子癇前期胎盤組織差異性甲基化基因篩選及TNFAIP8在子癇前期胎盤及外周血的表達.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一章 子癇前期胎盤組織甲基化情況及差異性甲基化候選基因生物學功能分析
　　目的：
　　本課題采用病例對照研究，分析其可能參與的生物學功能及信號通路，聚焦可能與母胎界面相關的若干基因位點，旨在進一步尋找參與子癇前期發(fā)生發(fā)展相關的候選基因以備后續(xù)驗證。
　　方法：
　　1、實驗分組:選取年齡、產次及孕周相匹配的早發(fā)型子癇前期、晚發(fā)型子癇前期、對照組孕婦各3例進行甲基化芯片檢測。

2、
　　2、胎盤組織采集:分娩后30分鐘內從胎盤中選取4個1cm3大小標本切成細條，用無菌PBS緩沖液清洗干凈擦干，置于凍存管，-80℃冰箱保存。
　　3、差異性甲基化基因定位及生物學功能聚類分析:利用Pubmed或GALAXY數據庫識別差異甲基化位點在基因組中的位置;利用MEME數據庫識別與CpG島甲基化周圍結合的基序;采用DAVID數據庫對差異甲基化位點進行生物學功能聚類分析;Fischer's exact test比較聚

3、類分析后各信號通路的相對重要性。
　　結果：
　　1、甲基化芯片質控結果顯示，探針符合質控標準，實驗體系穩(wěn)定。熒光信號強度強，均一;背景值低，亞硫酸鹽轉換效率高。
　　2、早發(fā)型子癇前期與對照組、晚發(fā)型子癇前期和對照組胎盤對比共發(fā)現23308和18318個差異甲基化位點。同時滿足差異有統(tǒng)計學意義及探針落在TSS或5' UTR區(qū)域的位點分別為有999個和527個，交集有95個。
　　3、子癇前期和正常分娩胎盤對比的

4、差異性甲基化基因主要與以下生物學功能調控相關:多細胞生物過程、生長發(fā)育過程、多細胞生物發(fā)育過程、解剖結構發(fā)育、系統(tǒng)發(fā)育。
　　結論：
　　利用全基因組DNA甲基化芯片成功檢測了子癇前期與正常分娩的胎盤組織，結果顯示兩者確實存在某些基因位點的甲基化狀態(tài)改變。對芯片結果進行生物學信息分析發(fā)現，差異顯著性基因涉及多條信息通路，主要和細胞生物過程、各系統(tǒng)及解剖結構發(fā)育相關。由于涉及的基因數量龐大，可選擇某些位點進一步進行驗證，為進一

5、步研究子癇前期病理生理的變化規(guī)律，探討有效診治方法奠定基礎。
　　第二章 與免疫相關的差異性甲基化候選基因選擇及焦磷酸測序驗證
　　目的：
　　采用焦磷酸測序技術，通過該技術驗證篩選的差異性甲基化基因，比較早發(fā)型子癇前期、晚發(fā)型子癇前期和正常孕婦胎盤組織中該位點的甲基化差異，為后續(xù)該基因位點的蛋白表達及其與子癇發(fā)病的關聯(lián)研究提供更多的證據。
　　方法：
　　1、實驗分組:選擇2013年3月至2014年5月在

6、福建省立醫(yī)院產科分娩的46例孕婦，早發(fā)型子癇前期組16例，晚發(fā)型子癇前期組12例，正常足月分娩孕婦18例。
　　2、確定焦磷酸測序目標基因:同時滿足兩個條件:甲基化差異矯正后有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，M＞1.0或M＜-1.0），限定探針分布在轉錄起始位點或5'UTR區(qū)域的位點。同時，該基因應為編碼蛋白質的基因，在胎盤和外周血均有表達，且其基礎甲基化水平較高。
　　3、焦磷酸測序:設計引物，每個樣本各取1～2μg用EpiTe

7、ct Plus DNA Bisulfite Kit甲基化轉化試劑盒進行轉化。以轉化后的DNA樣本做模板進行PCR，取PCR產物在PyroMark Q24實時定量焦磷酸系列分析儀上進行測定。
　　結果：
　　1、確定驗證的目標基因:排除假基因，選擇交集中兩個基因之一KIR2DL4。在早發(fā)型和對照組比較差異顯著的基因中，由于TNFAIP8在胎盤和淋巴細胞上表達水平較高，且與維持細胞穩(wěn)態(tài)和自身免疫調節(jié)功能密切相關，也予入選。

8、>　　2、三組年齡、孕次等無統(tǒng)計學差異，胎盤組織DNA質控評價合格。
　　3、TNFAIP8兩個位點的甲基化程度為10％左右。在TNFAIP8位點1中，早發(fā)型子癇前期組和其他兩組相比甲基化程度的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.03);而晚發(fā)型子癇前期組和對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。三組間TNFAIP8位點2的甲基化程度差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論：
　　選擇待驗證的基因位點除了要考慮基因類型

9、、基礎甲基化水平，還必須考慮該基因表達的器官及可能參與子癇前期發(fā)展的途徑，否則會增加測序驗證的風險，浪費不必要的經濟資源。早發(fā)型子癇前期相對于晚發(fā)型子癇前期和正常分娩胎盤組織，TNFAIP8基因甲基化水平明顯降低甚至未發(fā)生甲基化，而KIR2DL4基因的甲基化差異則無統(tǒng)計學差異。
　　第三章 TNFAIP8在子癇前期及正常分娩胎盤組織表達情況的差異
　　目的：
　　本研究旨在探討TNFAIP8因子在胎盤組織中的定位定量表

10、達情況，及與該基因在前期甲基化情況的關聯(lián)，有助于闡明子癇前期病理性損傷的機制。
　　方法：
　　1、實驗分組:選擇2013年3月至2014年8月在福建省立醫(yī)院產科分娩的64例孕婦，早發(fā)型子癇前期組23例，晚發(fā)型子癇前期組16例，正常足月分娩孕婦25例。
　　2、胎盤組織采集:分娩后30分鐘內從胎盤中選取4個1 cm3大小標本切成細條，用無菌PBS緩沖液清洗干凈擦干，置于凍存管，-80℃冰箱保存。
　　3、胎盤組織

11、免疫組化:取盡可能新鮮0.5cm×0.5cm×0.1cm胎盤組織塊，PBS沖洗后用4％多聚甲醛固定。包埋組織塊、切片、脫蠟、入水、加入抗體、染色。選擇實驗組和對照組的陽性和陰性組織相、進行100×和400×的顯微照相，分析圖像。
　　結果：
　　1、胎盤免疫組化結果:胎盤絨毛結構外圍的合體滋養(yǎng)層細胞，絨毛內部血管內皮細胞TNFAIP8表達陽性。早發(fā)型子癇前期在陽性細胞數、陽性細胞顯色強度及IHS評分方面，與晚發(fā)型子癇前期和正

12、常胎盤組織相比明顯增加。
　　2、胎盤組織熒光定量RT-PCR結果:三組間胎盤TNFAIP8mRNA相對表達量差異，兩兩相比均有統(tǒng)計學差異(P=0.000)，早發(fā)型子癇前期的TNFAIP8mRNA表達量較晚發(fā)型子癇前期及對照組增多，晚發(fā)型子癇前期的TNFAIP8mRNA表達量較對照組增多(P=0.000)。
　　3、胎盤組織Western Blot結果:三組TNFAIP8電泳條帶顯色按照早發(fā)型子癇前期、晚發(fā)型子癇前期、對照組

13、順序逐漸遞減。三組胎盤TNFAIP8蛋白表達量差異兩兩相比均有統(tǒng)計學差異(P=0.000)，早發(fā)型子癇前期的TNFAIP8蛋白表達量較晚發(fā)型子癇前期及對照組增多(P=0.000)，晚發(fā)型子癇前期的TNFAIP8蛋白表達量較對照組增多(P=0.000)。
　　結論：
　　根據前期胎盤組織甲基化芯片和焦磷酸測序的驗證結果，TNFAIP8基因明顯低甲基化甚至未甲基化，按照一般規(guī)律TNFAIP8的轉錄及表達應該明顯增高。本章驗證了該

14、推測，在胎盤組織中，早發(fā)型子癇前期的TNFAIP8表達明顯高于晚發(fā)型子癇前期及正常孕婦，而晚發(fā)型子癇前期的TNFAIP8表達也明顯高于正常孕婦。因此推測早發(fā)型子癇前期和晚發(fā)型子癇前期的TNFAIP8基因在胎盤有類似的甲基化和蛋白表達模式。
　　第四章 TNFAIP8在子癇前期和正常分娩孕婦外周血表達情況的差異
　　目的：
　　本章擬通過觀察外周血淋巴細胞TNFAIP8的表達變化規(guī)律，探討TNFAIP8作為血液標志物的可

15、行性。
　　方法：
　　1、實驗分組:選擇2013年3月至2014年8月在福建省立醫(yī)院產科分娩的64例孕婦，早發(fā)型子癇前期組23例，晚發(fā)型子癇前期組16例，正常足月分娩孕婦25例。
　　2、外周血采集:子癇前期孕婦及正常足月妊娠孕婦入院后抽取肘靜脈血液3ml×2管，置于EDTA抗凝管中，-80℃冰箱保存。
　　3、外周血熒光定量RT-PCR:實驗步驟同第三章。
　　4、外周血淋巴細胞蛋白Western Bl

16、ot:提取外周血液淋巴細胞總蛋白，加入裂解液用槍吹打數下，使裂解液充分接觸細胞將細胞裂解。懸浮細胞，收集培養(yǎng)細胞，裂解物經離心3～5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)實驗。其余實驗步驟同第三章。
　　結果：
　　1、外周血熒光定量RT-PCR結果:實時擴增及產物溶解曲線圖顯示目的基因和內參基因的擴增效率一致，擴增產物單一。三組間外周血淋巴細胞TNFAIP8mRNA相對表達量差異兩兩相比均有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，早發(fā)型子癇前期

17、的TNFAIP8mRNA表達量較晚發(fā)型子癇前期及對照組增多有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，晚發(fā)型子癇前期的TNFAIP8mRNA表達量較對照組增多有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。
　　2、外周血淋巴細胞蛋白Western Blot結果:三組外周血TNFAIP8電泳條帶顯色按照早發(fā)型子癇前期、晚發(fā)型子癇前期、對照組順序逐漸遞減。三組胎盤TNFAIP8蛋白表達量差異兩兩相比均有統(tǒng)計學差異（P=0.000）。早發(fā)型子癇前期的TNFAIP