不同氧濃度下人孤雌胚胎干細(xì)胞基因組印跡的初步研究.pdf

1、人類胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells，hESC）來源于人囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，能夠在體外無限增殖并且具有向三胚層分化的潛能。因此，hESC在再生醫(yī)學(xué)、胚胎發(fā)育以及藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，受精卵來源的hESC不僅因涉及胚胎的毀壞而存在較大的倫理爭議，而且干細(xì)胞移植后的免疫排斥至今仍是hESC應(yīng)用于臨床的一大障礙。而人孤雌胚胎干細(xì)胞（Human parthenogenetic embryonic st

2、em cell，hpESC）的建立不需要破環(huán)人類胚胎，且其MHC等位基因多是純合子，免疫源性低，可極大減少移植后產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，在再生醫(yī)學(xué)及干細(xì)胞治療上有巨大的應(yīng)用前景。然而，由于缺少父系基因，這種細(xì)胞的表觀遺傳穩(wěn)定性還不很明確。hpESC在體外培養(yǎng)及傳代中表觀遺傳的穩(wěn)定是其臨床應(yīng)用的前提。本研究選擇了表觀遺傳學(xué)的一個重要組成部分—基因組印跡，利用全基因組表達(dá)譜芯片以及實時熒光定量PCR等方法對不同氧濃度下2株hpESC及1株受精卵

3、來源的hESC的基因組印跡穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究，探討低氧及長期培養(yǎng)對人胚胎干細(xì)胞表觀遺傳穩(wěn)定性的影響，評估孤雌及受精卵來源hESC的臨床應(yīng)用安全性。本研究表明，在5％氧濃度的培養(yǎng)條件下，2株hpESC具有正常hESC的生物學(xué)特性且核型正常，并且低氧通過HIF-2a的上調(diào)增強了hESC及hpESC中多能性基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的氧濃度會引起hESC和hpESC中印跡基因表達(dá)水平的改變，而不同的印跡基因?qū)ρ鯘舛鹊姆磻?yīng)不同，而HIF可能是

4、低氧調(diào)節(jié)人胚胎干細(xì)胞表觀遺傳穩(wěn)定性的關(guān)鍵因子。但是，盡管在低氧的條件下，體外的長期培養(yǎng)仍然會影響hESC和hpESC印跡基因表達(dá)的穩(wěn)定性。因此，對比氧濃度，體外的長期培養(yǎng)是影響hESC和hpESC臨床應(yīng)用安全性的首要因素。
　　第一部分低氧條件下培養(yǎng)人孤雌胚胎干細(xì)胞及其生物學(xué)特性鑒定
　　【研究目的】
　　1.建立穩(wěn)定的低氧培養(yǎng)體系（5%O2），為后續(xù)研究開展奠定基礎(chǔ)。
　　2.在5%氧濃度下，對本實驗室現(xiàn)有的2

5、株人孤雌胚胎干細(xì)胞(FY-phES-018和chHES-32)以及1株正常受精卵來源的人胚胎干細(xì)胞（FY-hES-7）進(jìn)行培養(yǎng)并對其進(jìn)行胚胎干細(xì)胞特性的鑒定，為后續(xù)實驗提供材料。
　　【材料方法】
　　1.采用三氣培養(yǎng)箱（5%O2/5%CO2/90%N2）建立5%氧濃度的低氧培養(yǎng)體系，以傳統(tǒng)的常氧培養(yǎng)體系（21%O2）作為對照。
　　2.將本實驗室前期建立的1株hpESC系(FY-phES-018)、1株hESC系（F

6、Y-hES-7）和來源于人類干細(xì)胞國家工程研究中心的另一株hpESC系(chHES-32)在5%氧濃度的條件下，進(jìn)行體外培養(yǎng)傳代。進(jìn)行干細(xì)胞特異性抗原SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81等染色鑒定以及體外分化能力檢測。
　　3.體外培養(yǎng)hpESC和hESC保持未分化狀態(tài)，收集早晚代次的的細(xì)胞，提取基因組總RNA和DNA。
　　4. RT-PCR檢測干細(xì)胞未分化分子標(biāo)記基因的表達(dá)情況。
　　5.

7、實時熒光定量PCR檢測多能性基因（NANOG和SOX2）及低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1a和HIF-2a）在不同氧濃度下hESC和hpESC中的表達(dá)水平。
　　6.對3株細(xì)胞系進(jìn)行核型分析并對2株hpESC系進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測。
　　【結(jié)果】
　　1.建立了穩(wěn)定的低氧培養(yǎng)體系。低氧培養(yǎng)的2株hpESC和1株hESC均具有典型hESC克隆的形態(tài)，表達(dá)干細(xì)胞特異性抗原SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60，T

8、RA-1-81并且具有在體外自發(fā)分化形成擬胚體的能力且表達(dá)三個胚層的分化標(biāo)志基因。
　　2.未分化分子標(biāo)記基因NANOG，SOX2，OCT4，THY1和REX-1均在hESC和hpESC中均呈陽性表達(dá)。
　　3. NANOG、SOX2和HIF-2a在低氧組同株細(xì)胞中的表達(dá)量高于常氧組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)（P<0.05）；而HIF-1a在不同氧濃度組同株細(xì)胞中的表達(dá)量差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.2株hpE

9、SC在低氧條件下都保持正常的核型：46，XX。細(xì)胞系之間的STR位點顯示不一樣，證明來自不同的胚胎。
　　【結(jié)論】
　　1.2株hpESC系及1株hESC系在5%氧濃度的環(huán)境中能夠維持人胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性，具有不斷增殖及分化的能力。
　　2.低氧通過上調(diào)HIF-2a的表達(dá)增強了hESC及hpESC中多能性基因NANOG和SOX2的表達(dá)。由于低氧（5%O2）更接近胚胎在體內(nèi)發(fā)育的生理氧濃度，所以低氧的培養(yǎng)體系可能更有

10、利于胚胎干細(xì)胞的生長，這也為后續(xù)關(guān)于低氧的研究提供了可靠的細(xì)胞材料。
　　第二部分不同氧濃度下人孤雌胚胎干細(xì)胞印跡基因的表達(dá)狀態(tài)
　　【研究目的】
　　對不同氧濃度下未分化hpESC的印跡基因表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行動態(tài)觀察比較，初步探討低氧對hESC及hpESC表觀遺傳學(xué)穩(wěn)定性的影響，明確低氧培養(yǎng)是否有利于維持hpESC的印跡穩(wěn)定性，評價hpESC的臨床應(yīng)用可行性，為人類胚胎干細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的深入研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　【

11、材料方法】
　　1.利用建立的低氧培養(yǎng)體系與實驗室傳統(tǒng)的常氧培養(yǎng)體系平行培養(yǎng)2株hpESC和1株本實驗室前期建立的受精卵來源的hESC。
　　2.采用全基因組表達(dá)譜芯片測定不同氧濃度下2株未分化hpESC和1株hESC中的印跡基因表達(dá)狀態(tài)，篩選出不同氧濃度下相同代次的細(xì)胞中發(fā)生差異表達(dá)的印跡基因以及長期低氧條件下發(fā)生差異表達(dá)的印跡基因。比較不同氧濃度下及長期低氧條件下各株干細(xì)胞印跡基因表達(dá)的變化率。
　　3.實時熒光定

12、量PCR驗證部分差異性表達(dá)印跡基因的表達(dá)水平。
　　4.對hpESC的印跡基因表達(dá)譜進(jìn)行聚類分析，采用Gene Ontology(GO) analysis對來源于同一細(xì)胞系在不同氧濃度下培養(yǎng)的干細(xì)胞中差異表達(dá)的印跡基因進(jìn)行基因功能分析。
　　5.比較差異表達(dá)印跡基因在不同hpESC系中變化的異同點。
　　【結(jié)果】
　　1.在長期低氧培養(yǎng)條件下，F(xiàn)Y-hES-7晚代細(xì)胞（P52）與相同條件下的早代細(xì)胞（p37）相比

13、，共檢測出47個印跡基因，發(fā)現(xiàn)30個印跡基因發(fā)生差異性表達(dá)（>2倍），其中16個表達(dá)上調(diào)，14個表達(dá)下調(diào)。通過GO分析發(fā)現(xiàn)這些印跡基因富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控，各系統(tǒng)器官的發(fā)育以及調(diào)節(jié)生物代謝過程等。
　　2.在長期低氧培養(yǎng)條件下，F(xiàn)Y-phES-018晚代細(xì)胞（P52）與相同條件下的早代細(xì)胞（p37）相比，檢測獲得48個印跡基因，發(fā)生差異性表達(dá)（>2倍）的印跡基因29個，其中17個表達(dá)上調(diào)，12個表達(dá)下調(diào)；chHES-32晚代細(xì)胞（p52

14、）與相同條件下的早代細(xì)胞（p37）相比，檢測獲得印跡基因78個，其中差異性表達(dá)印跡基因61個，表達(dá)上調(diào)的基因34個，下調(diào)基因27個。通過對這些差異性表達(dá)的印跡基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)，這些印跡基因富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控，各系統(tǒng)器官發(fā)育與形態(tài)以及調(diào)節(jié)生物代謝過程。
　　3.對比5%氧濃度下同一細(xì)胞系的晚代細(xì)胞，21%氧濃度下FY-hES-7晚代細(xì)胞中共檢測獲得59個印跡基因，發(fā)生差異性表達(dá)（>2倍）的印跡基因37個，其中23個基因表達(dá)上調(diào)，14

15、個基因表達(dá)下調(diào)。這些基因的GO分析顯示：這些印跡基因富集于RNA代謝過程的調(diào)節(jié)，胞外區(qū)域部分以及生長因子活性。
　　4.對比5%氧濃度下同一細(xì)胞系的晚代細(xì)胞，21%氧濃度下FY-phES-018晚代細(xì)胞中檢測獲得印跡基因53個，發(fā)生差異性表達(dá)（>2倍）的印跡基因34個，其中13個基因表達(dá)上調(diào)，21個基因表達(dá)下調(diào)；21%氧濃度下chHES-32晚代細(xì)胞中檢測獲得75個印跡基因，發(fā)生差異性表達(dá)（>2倍）的印跡基因44個，其中表達(dá)發(fā)生上

16、調(diào)的基因23個，下調(diào)的基因21個。通過對這些基因進(jìn)行GO分析發(fā)現(xiàn)這些印跡基因富集于各系統(tǒng)器官的形成與發(fā)育，轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄因子活性以及生物調(diào)節(jié)功能等。
　　5.不同氧濃度下各株細(xì)胞系之間印跡基因變化率的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其中 hpESC與 hESC之間的印跡基因變化率不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；2株 hpESC細(xì)胞之間的印跡基因變化率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。長期低氧培養(yǎng)的3株細(xì)胞系印跡基因變化率的差

17、異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；hpESC與hESC之間的印跡基因變化率不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；但是在長期低氧培養(yǎng)后，chHES-32細(xì)胞印跡基因的變化率高于比 FY-phES-018細(xì)胞，2株hpESC細(xì)胞之間的印跡基因變化率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　6.部分印跡基因的實時熒光定量PCR驗證結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致。
　　7.基因聚類分析結(jié)果顯示，在FY-phES-018和FY-hES-7細(xì)胞系

18、中，5%氧濃度下早代和晚代細(xì)胞的印跡基因表達(dá)譜接近，而兩種氧濃度下的chHES-32晚代細(xì)胞的印跡基因表達(dá)譜較接近。
　　8.在長期低氧的條件下，不同的hpESC系中相同的印跡基因發(fā)生變化的趨勢不同，這些基因包括GATA3，CYP1B1，NKX6-2，BRUNOL4，SNURF，MYEOV2，KLF14，LMX1B和PEG3。在不同氧濃度下各hpESC系中發(fā)生差異性表達(dá)的印跡基因中一些基因的變化趨勢不一致，這些基因包括CSF2，F(xiàn)