小鼠未成熟卵孤雌胚胎干細(xì)胞系的建立及其印跡基因的研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞具無限增殖和多向分化潛能，在發(fā)育生物學(xué)的研究、新基因的發(fā)現(xiàn)和功能研究以及組織器官移植重建等領(lǐng)域都具有重要的科學(xué)意義、巨大的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益。但是由于胚胎干細(xì)胞材料主要是來源于胚胎，因而必須面對(duì)損毀生命的倫理學(xué)爭議和應(yīng)用于臨床治療時(shí)出現(xiàn)的免疫排斥問題。目前一方面是可提供的人類卵子有限，一方面是生殖醫(yī)學(xué)中心存在大量廢棄的未成熟卵子。孤雌胚胎干細(xì)胞是解決這兩個(gè)問題的有效途徑。本研究旨在建立一小鼠未成熟卵分離孤雌胚胎干細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)

2、模型，為將來構(gòu)建高效穩(wěn)定的應(yīng)用于人未成熟卵分離孤雌干細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)；并初步探索印跡基因在孤雌胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)和作用。
　　 本課題首先是建立了一未成熟卵培養(yǎng)體系，通過氯化鍶和細(xì)胞松弛素D聯(lián)合孤雌激活得到高效率的囊胚發(fā)育，并進(jìn)一步摸索了一套適合未成熟卵孤雌干細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法。分離到具有較強(qiáng)分化潛能的孤雌胚胎干細(xì)胞，尤其是其生殖系轉(zhuǎn)移效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以往有關(guān)孤雌干細(xì)胞生殖系轉(zhuǎn)移效率的報(bào)導(dǎo)?？紤]孤雌干細(xì)胞來源于未成熟卵，對(duì)未成熟卵及其孤

3、雌囊胚和干細(xì)胞從印跡基因甲基化和表達(dá)上做了進(jìn)一步的機(jī)制探討。具體研究內(nèi)容包括以下四部分：
　　 通過對(duì)小鼠未成熟卵體外成熟和孤雌激活，發(fā)現(xiàn)B6C3F1未成熟卵培養(yǎng)成熟后孤雌激活囊胚率為86％，低于對(duì)照組體內(nèi)成熟卵孤雌激活囊胚率100％； B6129Fl未成熟卵培養(yǎng)成熟后孤雌激活囊胚率為65％，低于對(duì)照組體內(nèi)成熟卵孤雌激活囊胚率98％。
　　 小鼠未成熟卵孤雌囊胚移植在MEF上后，原代生長培養(yǎng)和傳代：改良培養(yǎng)體系，用含KS

4、R的干細(xì)胞培養(yǎng)液代替FBS干細(xì)胞培養(yǎng)液在B6C3F1品系中成功地分離到17株未成熟卵孤雌干細(xì)胞，其中用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液分離了11株，效率為11％；KSR的培養(yǎng)液分離了6株，其效率為42.9％。在B6129F1品系中，用KSR的培養(yǎng)液分離到7株，其分離效率為21.2％。用KSR的培養(yǎng)液分離效率高于FBS的培養(yǎng)液分離效率。
　　 對(duì)未成熟卵孤雌激活分離的干細(xì)胞進(jìn)行多能性的相關(guān)鑒定。小鼠未成熟卵孤雌干細(xì)胞系1116核型正常，具有干細(xì)胞

5、系有關(guān)的生物學(xué)特征，體外擬胚體實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)畸胎瘤實(shí)驗(yàn)都證明其能向胚胎發(fā)育的三個(gè)胚層分化。另外1116pES(B6C3F1品系)和11191pES(B6129F1品系)嵌合體生殖系轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證明未成熟卵孤雌干細(xì)胞是具有較高的生殖系轉(zhuǎn)移效率，接近于正常受精干細(xì)胞系的生殖系轉(zhuǎn)移效率。
　　 小鼠未成熟卵孤雌干細(xì)胞印跡基因和甲基化狀態(tài)方面的研究發(fā)現(xiàn)：1、體外未成熟卵Impact基因的mRNA表達(dá)的量高于體內(nèi)成熟卵的表達(dá)量；2、未成熟卵來源孤

6、雌囊胚H19表達(dá)量低于成熟卵孤雌囊胚，但二者都高于正常受精囊胚，孤雌囊胚Snrpn和Slc38a4不表達(dá)或表達(dá)偏低；3、未成熟卵來源的孤雌胚胎干細(xì)胞IVM1116pES和成熟卵來源干細(xì)胞C3pES中H19表達(dá)量都高于正常受精胚胎干細(xì)胞BF10，但I(xiàn)VM1116pES中H19表達(dá)量更趨于接近BF10表達(dá)量；4、H19基因DMR區(qū)從卵子到孤雌囊胚、孤雌生殖干細(xì)胞基本為未甲基化狀態(tài)，而Snrpn在卵子完全甲基化到孤雌囊胚少量去甲基化；1116