雜合孤雌胚胎干細(xì)胞的分離及其分化潛能的研究.pdf

1、本研究通過將小鼠第二次減數(shù)分裂中期(MII)卵子的紡錘體移植到另一枚卵子中,孤雌激活后排出兩個極體；體外發(fā)育得到囊胚,進而從中分離出胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs),并進行了形態(tài)學(xué)觀察、核型分析、堿性磷酸酶染色、OCT-4染色、SSEA-1染色和類胚體形成等一系列的檢測。為了探究此ES細(xì)胞的體內(nèi)分化潛能,通過囊胚注射ES細(xì)胞的方法制備了嵌合小鼠,流式細(xì)胞分析嵌合體小鼠心臟,脾臟,腎臟和骨髓中的嵌合程度,將

2、所得到的嵌合體小鼠與昆明小鼠進行交配以檢驗該細(xì)胞系是否具有生殖系轉(zhuǎn)化能力。 1.核移植重構(gòu)胚構(gòu)建及體外發(fā)育在構(gòu)建紡錘體移植的重構(gòu)胚過程中,共使用轉(zhuǎn)EGFP基因小鼠體內(nèi)成熟MII卵母細(xì)胞160枚作為紡錘體供體卵子,紡錘體受體卵子為昆明小鼠體內(nèi)成熟MII卵子,核移植成功操作114枚(71.25％)。將此移入轉(zhuǎn)EGFP基因小鼠紡錘體的卵子進行電融合處理,共有103枚(90.35％)卵子融合。再將成功融合的卵子進行SrCl2激活,6小時

3、后,有69枚重構(gòu)卵子(66.99％)形成2個原核并排出兩個極體。將這已激活的重構(gòu)胚在KSOM發(fā)育培養(yǎng)液中體外發(fā)育培養(yǎng),共得到12枚囊胚,囊胚發(fā)育率為17.39％。 2.胚胎干細(xì)胞分離及鑒定所有12枚囊胚種植到經(jīng)絲裂霉素處理的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上。 5-6d后,形成7個鳥巢狀結(jié)構(gòu),其中3個內(nèi)細(xì)胞團生長良好,從這3個鳥巢狀結(jié)構(gòu)中分離得到3株孤雌胚胎干細(xì)胞系。形態(tài)觀察:ES細(xì)胞呈克隆狀生長,細(xì)胞緊密地聚集在一起,形似鳥巢

4、,內(nèi)部細(xì)胞界限不清,核大,胞漿少。熒光顯微鏡觀察顯示ES細(xì)胞克隆發(fā)出很強的綠色熒光。 核型分析:ES細(xì)胞具有正常二倍體核型,共40條染色體。 堿性磷酸酶(AKP)染色:ES細(xì)胞克隆被染成深藍色,說明細(xì)胞顯示堿性磷酸酶活性。 SSEA-1染色和OCT-4染色：呈陽性。 類胚體:EGFP標(biāo)記的ES細(xì)胞在體外分化形成類胚體表明具有很好的分化潛能,形成的類胚體在熒光顯微鏡下發(fā)出很強的綠色熒光。 3.雜合孤

5、雌胚胎干細(xì)胞(Hvbrid parthenogenetic stem cells,HP-ES)體內(nèi)分化研究收集昆明小鼠的囊胚作為受體胚胎,制備ES細(xì)胞的單細(xì)胞懸液作為供體細(xì)胞,然后進行ES細(xì)胞囊胚腔注射,每個囊胚腔內(nèi)注入10～15個ES細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)1h后,共移植到假孕受體中175枚,使用假孕受體11只,產(chǎn)仔共44只,其中毛色嵌合小鼠6只。生殖系嵌合能力檢測：將此6只嵌合體小鼠與昆明小鼠交配,其中1只嵌合體的后代中出現(xiàn)黑毛色小鼠,說明此