雙酚A對小鼠胚胎干細(xì)胞分化潛能的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、雙酚A(bisphenolA,BPA)廣泛存在于人類生存環(huán)境中,與人的各種生產(chǎn)、生活活動密切相關(guān),人體普遍暴露于雙酚A中,尤其是孕婦的暴露日益受到關(guān)注。經(jīng)典的毒理學(xué)研究指出一定劑量的BPA可能抑制胚胎發(fā)育。19世紀(jì)末以前,因受實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段和醫(yī)學(xué)倫理學(xué)方面的限制,難以開展早期胚胎發(fā)育宮內(nèi)研究,這使人們對BPA對胎兒早期發(fā)育的影響及其機(jī)制知之甚少,且主要停留在動物實(shí)驗(yàn)階段。20世紀(jì)末以來,胚胎干細(xì)胞理論和技術(shù)及其應(yīng)用的快速發(fā)展,為外源化學(xué)物

2、的毒性研究提供了新的手段。本研究選用雙酚A作用于小鼠胚胎干細(xì)胞(mouseembryonicstemcell,mESC)并開展系列相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞水平評價(jià)雙酚A的胚胎毒性,為合理評價(jià)BPA的安全性提供科學(xué)依據(jù);同時(shí)觀察BPA是否可以通過改變部分基因啟動子區(qū)甲基化水平進(jìn)而影響特定基因的表達(dá),為進(jìn)一步研究BPA的早期胚胎發(fā)育影響及其機(jī)制提供新思路。
　　目的:1、通過體外飼養(yǎng)層支持培養(yǎng)S6系小鼠胚胎干細(xì)胞,應(yīng)用胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

3、(EST)評價(jià)BPA的胚胎毒性,同時(shí)觀察不同濃度BPA對擬胚體生長分化的影響,為合理評價(jià)BPA的安全性及探索雙酚A對小鼠胚胎干細(xì)胞分化潛能的影響提供依據(jù)。2、mES細(xì)胞采用條件培養(yǎng)基培養(yǎng),觀察不同濃度BPA對其細(xì)胞毒性及OCT4、SOX2及Nanog基因表達(dá)水平的影響,同時(shí)檢測BPA對mES細(xì)胞OCT4基因啟動子區(qū)DNA甲基化情況,為進(jìn)一步研究BPA的早期胚胎發(fā)育影響及其機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:1、采用飼養(yǎng)層支持培養(yǎng)mES細(xì)

4、胞,設(shè)置溶劑對照(DMSO)、BPA(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L,所用BPA濃度涵蓋了環(huán)境相關(guān)濃度和較高濃度對照)。利用懸滴、懸浮培養(yǎng)方法,通過對不同濃度BPA作用下,mES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞能力的檢測,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,結(jié)合相應(yīng)CCK-8法檢測BPA對mES細(xì)胞及小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3的半數(shù)抑制濃度(IC50),通過分化抑制試驗(yàn)得到雙酚A對小鼠

5、胚胎干細(xì)胞的50％分化抑制濃度(ID50),再根據(jù)判別公式評價(jià)雙酚A的胚胎毒性,并篩選合適的濃度用于后期分化誘導(dǎo)。2、結(jié)合ES細(xì)胞半數(shù)分化抑制濃度和相關(guān)文獻(xiàn),設(shè)置溶劑對照(DMSO)、BPA(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)和E210-9mol/L雌二醇對照組。將mES細(xì)胞通過懸滴、懸浮培養(yǎng)方法獲得擬胚體(EB),并在不添加任何誘導(dǎo)因子的體系中連續(xù)培養(yǎng)EB至10d,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT

6、-Q-PCR)法檢測內(nèi)胚層特征性基因(Transthyretin、AFP)、中胚層特征性基因(Flk-1、Gata-1)、外胚層特征性基因(Vimentin、Nestin)在EB中的mRNA表達(dá)情況,觀察雙酚A對擬胚體生長分化的影響。3、設(shè)置溶劑對照(DMSO)、BPA(1.56×10-5mol/L、3.12×10-5mol/L、6.25×10-5mol/L、1.25×10-4mol/L、2.5×10-4mol/L、5×10-4mol/

7、L、1×10-3mol/L、2×10-3mol/L等8個(gè)濃度組,染毒mES細(xì)胞24h后,CCK-8法檢測BPA對細(xì)胞增殖的影響,計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。然后選擇mES細(xì)胞暴露不同濃度BPA(0、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L)24h,分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測雙酚A作用下OCT4、SOX2在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化。4、結(jié)合堿基

8、特異性酶切反應(yīng)與MALDI-TOF-MS檢測原理,運(yùn)用Sequenom公司的MassARRAY檢測系統(tǒng),檢測OCT4基因啟動子區(qū)DNA甲基化情況。
　　結(jié)果:1、按照胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法,得到其三個(gè)反應(yīng)終點(diǎn)IC50ES、IC503T3、ID50分別為:5.22×10-4mol/L,6.25×10-4mol/L、7×10-7mol/L,同時(shí)將三者帶入到預(yù)測模型的三個(gè)線性判別函數(shù)中,根據(jù)模型判斷標(biāo)準(zhǔn),判斷BPA屬于強(qiáng)胚胎毒性化合物。2、

9、在一定濃度范圍內(nèi),BPA對內(nèi)胚層特征性基因(Transthyretin、AFP)及外胚層特征性基因(Vimentin、Nestin)的影響不明顯(P>0.05);而對中胚層特征性基因(Flk-1、Gata-1)影響,表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢,在較低濃度組10-9mol/L及10-8mol/L升高(P<0.05),在較高濃度組和陽性對照組降低。3、BPA對mESC有一定的毒性作用,染毒濃度越大,細(xì)胞活性越小,二者呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,并通過計(jì)

10、算得出BPA對mESC的IC50為4.3×10-4mol/L,同時(shí)結(jié)合BPA的環(huán)境相關(guān)暴露濃度和相關(guān)資料,最終取10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L五個(gè)濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度;BPA處理24h后,mESC細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,較高濃度組與對照組比較,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,出現(xiàn)少許漂浮的細(xì)胞,克隆變得不規(guī)則,分化趨勢明顯。BPA濃度為10-7mol/L組、10-6mol/L組、10-5mol/L組、10-4mol/L組的OCT

11、4mRNA相對表達(dá)水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05);BPA濃度為10-4mol/L組的SOX2mRNA相對表達(dá)水平高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值<0.05);BPA濃度為10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L濃度組Nanog的mRNA表達(dá)水平低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。BPA濃度為10-5mol/L組、10-4mol/L組的OCT4蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平均高于DMSO組,差異有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05);而各濃度組SOX2蛋白相對表達(dá)水平均未發(fā)現(xiàn)明顯改變;而Nanog蛋白相對表達(dá)水平呈先升高后下降的趨勢,在10-7mol/L達(dá)到最高,而在10-4mol/L達(dá)到最低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4、經(jīng)SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的DNA樣品,CpG甲基化程度明顯高于其他任何一組的DNA樣品,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示該檢測方法的靈敏度良好。與溶劑對照組比較,DAC和TSA處理組OCT4基因CpG

13、甲基化率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與溶劑對照組比較,BPA處理組CpG甲基化率,隨著染毒劑量的升高有下降的趨勢,但變化不是很明顯,僅在10-5mol/L濃度組下降較為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、成功分離培養(yǎng)了C57/BL6系小鼠來源的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,并可進(jìn)行7代以內(nèi)的傳代培養(yǎng),成功對mES細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。初步建立小鼠EST體系,并利用該體系對BPA的胚胎毒性進(jìn)行分類,判斷

14、BPA屬于強(qiáng)胚胎毒性化合物。
　　2、成功將mES細(xì)胞分化成擬胚體,在一定濃度范圍內(nèi),隨著BPA染毒濃度的升高,擬胚體中胚層特征性基因表達(dá)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,提示在較低濃度范圍內(nèi)的BPA對mES細(xì)胞的分化潛能有影響,尤其對分化為中胚層細(xì)胞影響較大,促進(jìn)其向中胚層分化。
　　3、BPA在一定濃度范圍內(nèi)可增強(qiáng)OCT4基因的表達(dá),對SOX2基因表達(dá)無明顯影響,而在一定程度上降低Nanog基因的表達(dá),提示OCT4、SOX2及Na