Sox17對小鼠胚胎干細(xì)胞分化的影響.pdf

1、干細(xì)胞(Stem cell，SC)是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，有很高的可塑性。在一定條件下，SCs可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組織器官的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC)是受精卵分裂發(fā)育成囊胚時，內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)（Inner cell mass）來源的細(xì)胞，其發(fā)育受多種內(nèi)在機制和微環(huán)境因素的影響，大量的細(xì)胞因子通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系對細(xì)胞的增值和分化進(jìn)行調(diào)控，使之向指定

2、的方向發(fā)展。目前，科學(xué)家已經(jīng)能夠在體外鑒別、分離、純化、擴(kuò)增和培養(yǎng)多種動物的ESC，建立了相應(yīng)的細(xì)胞系。ESC模型的建立，為體外研究胚胎發(fā)育過程中各種因子的作用機制奠定了基礎(chǔ)。 Sox(SRY-related HMG-box gene)因子屬于HMG(high mobility group)-box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在脊椎動物中高度保守，并在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。作為Sox家族的一員，Sox17在內(nèi)胚層發(fā)育過程中必不可少

3、。利用基因打靶技術(shù)制備的Sox17基因突變（Sox17-/-）小鼠原腸發(fā)育嚴(yán)重受阻，并導(dǎo)致胚胎致死。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)胚胎外胚層異位表達(dá)Sox17基因，可引起其向內(nèi)胚層分化。然而，目前對Sox17的研究還不深入（尤其在哺乳動物中），其在內(nèi)胚層分化過程中的作用機制尚不明確。研究表明，在爪蟾中Sox17與Wnt信號通路中的關(guān)鍵因子β-catenin相互作用，從而引起下游基因的特異性轉(zhuǎn)錄。綜上所述，針對Sox17因子的

4、生物學(xué)功能及其作用機理的深入研究，將對闡明胚胎發(fā)育的基因調(diào)控機制，多種組織器官的發(fā)生發(fā)育過程和調(diào)控機制，以及臨床多種畸形表型的發(fā)生機制等都具有十分重要的意義。 本實驗以小鼠ESC為研究對象，將鼠外源Sox17基因轉(zhuǎn)入該細(xì)胞中，制備Sox17過表達(dá)模型，體外培養(yǎng)該細(xì)胞。以該細(xì)胞為研究對象，通過細(xì)胞形態(tài)特征、半定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)等手段檢測其分化過程中的各項指標(biāo)（細(xì)胞水平、分子水平），研究Sox17在ESC分化過程中的功能

5、，以期進(jìn)一步探討其影響內(nèi)胚層分化的作用機制。 本實驗結(jié)果顯示： 1.帶有鼠源Sox17基因的質(zhì)粒載體pPyCAGIP通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染小鼠ESCE14/T，外源Sox17基因的轉(zhuǎn)染率大約為40％-50％。 2.與陰性對照（空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）相比，Sox17轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)存在的培養(yǎng)基中逐漸分化：細(xì)胞群落由集中變?yōu)?/p>

6、分散；干細(xì)胞多能性標(biāo)志基因Oct4，Rex-1表達(dá)水平明顯下降。 3.與陰性對照相比，Sox17轉(zhuǎn)染的細(xì)胞原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因Gata4，Gata6，Hnf1β，體壁內(nèi)胚層標(biāo)志基因LamininB1 (LamB1），Thrombomodulin (TM)，Disabled homolog2(Dab2)，Sparc表達(dá)上升。表明Sox17誘導(dǎo)ESC向原始內(nèi)胚層分化。 4.ESC在去除LIF的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)形成擬胚體(Emb

7、ryoid body，EB)。在EBs的第二天、第六天及第十天，與對照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了Sox17的EBs中原始內(nèi)胚層標(biāo)志基因Gata4,Gata6,Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor II(Coup-tfII),體壁內(nèi)胚層標(biāo)志基因LamB1，TM，Dab2，Sparc和臟壁內(nèi)胚層標(biāo)志基因Alpha fetoprotein(Afp)，Bone morphoge

8、netic protein2(Bmp2）表達(dá)上調(diào)。終末內(nèi)胚層標(biāo)志基因Intestinal fatty acid binding protein(Ifabp)，Pancreatic and duodenal homeobox1(Pdx-1)，中胚層標(biāo)志基因Actc表達(dá)上升。另外，Wnt信號通路關(guān)鍵因子β-catenin表達(dá)水平增加。說明Sox17誘導(dǎo)EBs向原始內(nèi)胚層及終末內(nèi)胚層分化。 綜上所述，Sox17可能與β-catenin