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文檔簡介
1、細胞核的重編程可以通過將體細胞的細胞核移入卵母細胞,將體細胞和胚胎干細胞進行融合,以及向體細胞中轉(zhuǎn)入幾個轉(zhuǎn)錄因子例如Oct4,Sox2,C-myc,Klf4和 Nanog的方法實現(xiàn),然而細胞核的重編程需要經(jīng)歷復(fù)雜的過程,其中最為重要的就是細胞核所發(fā)生的表觀遺傳學(xué)變化,本文主要綜訴了細胞核重編程的研究概況,產(chǎn)生干細胞的四種不同的方法和現(xiàn)代表觀遺傳學(xué)中干細胞的表觀遺傳學(xué)特性以及體細胞的表觀遺傳學(xué)變化。
我們從培養(yǎng)ES細胞著手,
2、通過一年的摸索初步建立了小鼠胚胎成纖維細胞的體外培養(yǎng)平臺,并在此基礎(chǔ)上利用小鼠胚胎成纖維細胞經(jīng)過絲裂霉素c處理的方法建立了合格的胚胎細胞滋養(yǎng)層。同時綜合國內(nèi)外文獻,采用對小鼠注射激素,超數(shù)排卵,沖取3.5天的受精卵,接種于小鼠胚胎成纖維細胞制作的滋養(yǎng)層細胞上,在體外培養(yǎng)下使受精卵正常發(fā)育,并孵化,進而使受精卵在體外貼壁,等內(nèi)細胞團長大時用機械的方法挑取內(nèi)細胞團,從而建立了三株小鼠的胚胎干細胞系,經(jīng)過分子水平的鑒定,基本確定細胞系的成功。
3、
基于胚胎細胞完整的培養(yǎng)體系,我們成功培養(yǎng)了ES細胞系,核移植胚胎干細胞系,IPS細胞系各兩株,在實驗室培養(yǎng)擴大后分別提取了各個細胞系的總RNA。在此基礎(chǔ)上設(shè)計定量引物,分別分析了與胚胎細胞表觀相關(guān)的表觀遺傳學(xué)基因,主要包括與DNA甲基化相關(guān)的基因Dnmt1、Dnmt3b、Dnmt3L、Aicda、與H3K27me3相關(guān)的基因Ezh2 Kdm6b Kdm6a,與H3K4me相關(guān)的基因 mllI LSDI與Histone A
4、c相關(guān)的基因Kat2a,以一株細胞ES細胞系作為對照,利用2-△△Ct法分析了這些基因在六株細胞系中的變化,結(jié)果顯示,在6個細胞系中ntES2 在各個基因中都比同類以及其他細胞系表達量要高,特別是在Dnmt1基因中要比同類細胞高出5倍多,由于此細胞在體外傳代次數(shù)較長已達到25代,因此有可能在體外傳代過程中引起細胞表觀修飾的改變,此現(xiàn)象已在文獻中有報道,對于此細胞系進一步的鑒定還需要進行。
與H3K27me3相關(guān)的基因Ezh
5、2、Kdm6b、Kdm6a、與H3K4me相關(guān)的基因 mllI LSDI與Histone Ac相關(guān)的基因Kat2a 在六個細胞系中的表達量均未表現(xiàn)出變化。
與DNA甲基化相關(guān)的基因中,Dnmt1基因在各個細胞系中的表達沒有表現(xiàn)出很明顯的變化,而Dnmt3b基因在兩株IPS細胞系中的表達量要比正常的ES細胞和核移植干細胞系低將近2倍。相反,Dnmt3L基因在兩株IPS細胞系中的表達量比正常的ES細胞和核移植ES細胞系高將近4
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