人類孤雌胚胎干細胞的表遺傳狀態(tài)-基因組印記初步研究.pdf

1、胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESC)來源于囊胚內(nèi)細胞團,ESC可分化為3個胚層的各種細胞并具有體外無限增殖的能力。人類胚胎干細胞(humanembryonic stem cells,hESC)的建系使ESC用于治療人類組織器官退化性疾病成為可能。將hESC分化為各種成體細胞,有望未來應(yīng)用于人類退變性疾病如帕金森氏病、阿爾茲默病、以及糖尿病等疾病的治療。然而,來源于受精囊胚的人類雙親胚胎干細胞(human bip

2、arental embryonic stem cells,hBESC)不僅與需要行細胞組織移植的患者存在遺傳學上的差異,而且目前仍然存在較大的倫理學爭議。2007年我中心建立了非受精囊胚來源的hESC系,即人類孤雌胚胎干細胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESC)。在電激活和化學激活作用下,人類MII卵子卵漿內(nèi)Ca2+振蕩,使其完成第二次減數(shù)分裂,并進一步發(fā)育形成胚胎,即為孤雌

3、激活。來源于人類孤雌囊胚的hPESC,與卵子提供者之間主要組織相容復(fù)合物(Majior histocompatibility complex,MHC)匹配,避免了移植后免疫排斥反應(yīng)及破壞受精胚胎所引起的倫理學爭議。
　　 但是由于缺乏父源性遺傳物質(zhì),hPESC的臨床應(yīng)用安全性值得我們進一步深入探討。既往的哺乳動物實驗表明:孤雌胚胎由于基因印記異常狀態(tài)導致其無法發(fā)育至成體。在人中已發(fā)現(xiàn)的印記基因約有60余個。這些基因己顯示在胚胎生

4、長、特定細胞系分化中起重要調(diào)控作用。印記基因等位特異性表達通常與DNA甲基化有關(guān)。大多數(shù)的DNA甲基化發(fā)生于差異甲基化區(qū)(Differentially methylatedregions,DMRs)。DMRs中親緣特異性甲基化使母源及父源等位基因得以區(qū)分,并調(diào)節(jié)印記基因的轉(zhuǎn)錄。由于孤雌胚胎中兩套基因組均為母源性的,理論上母本基因?qū)殡p倍表達,父本基因缺失。人類印記基因破壞或不適當表達與某些臨床綜合征及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。因此基因組印記可能

5、會成為hPESC用于臨床治療上的障礙。盡管鼠,兔,牛,非人靈長類,及人激活胚胎干細胞相繼建立,關(guān)于孤雌胚胎干細胞(Parthenogenetic embryonic stem cells,PESC)中印記狀態(tài)的認識仍然非常有限。至今沒有關(guān)于hPESC中印記基因表達狀態(tài)的研究。因此,評估hPESC中印記狀態(tài),以及印記基因在hPESC細胞體外長期培養(yǎng)及分化過程中的變化,評估hPESC表遺傳的安全性具有重要意義。
　　 本研究選擇了目

6、前所有有明確印記狀態(tài)的人類印記基因,在2株hPESC細胞系中用高通量PCR芯片的方法測定其mRNA水平,并和hBESC比較,從整體水平全面評估hPESC的印記狀態(tài)；并分析印記基因表達在長期傳代中的穩(wěn)定性；分析印記基因在hPESC早期分化一胚體(Embryoid body,EB)形成中表達水平的變化；用DNA甲基化測序的方法,探索印記基因表達其后的機制。
　　 第一部分未分化人類孤雌胚胎干細胞與人類雙親胚胎干細胞的印記基因表達狀態(tài)

7、比較
　　 研究目的：
　　 1.分析未分化hPES中印記基因表達狀態(tài)并與未分化hBES比較。
　　 2.探討未分化hPES體外長期培養(yǎng)對印記基因表達水平的影響。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗設(shè)計:本文選擇了所有目前在人類中有明確印記狀態(tài)(母源或父源表達)的基因,參見http://WWW.geneimprint.com；http://WWW.otago.ac.nz,共65個印記基因,其中父源

8、表達(父本)基因27個,母源表達(母本)基因38個。實驗材料:2株hPES1、hPES2,1株人類雙親胚胎干細胞(human biparentalembryomc stem cells,hBES)系:hBES。其中hBES設(shè)為對照組,hPES1、hPES2設(shè)為實驗組。每組取早代、中代、晚代細胞,分別檢測印記基因mRNA的表達。
　　 2.3株人類胚胎干細胞系均培養(yǎng)于小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse embryofibroblast

9、s,MEFs)飼養(yǎng)層上,按標準的人類胚胎干細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。各取不同的6個代次:早代(p27,p37)、中代(p47,p57)、晚代(p67,p77),每隔10代各取一次細胞,提取總RNA。
　　 3.對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PCR array的方法,進行SYBR Green實時定量PCR。
　　 4.比較3組間印記基因mRNA相對表達水平的差異。
　　 5.分析每組中傳代次數(shù)與印記基因mRNA

10、表達水平之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 6.比較每組中50代前后細胞的印記基因mRNA表達水平差異。
　　 7.比較在體外長期培養(yǎng)中3組間印記基因發(fā)生變化的異同點。
　　 8.分析染色體核型與印記基因表達異常的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對照組hBES比較,hPES1中母本基因ATP10A升高了2.7倍(P<0.05),ZNF264升高了6.5倍(P<0.001)；hPES2中ATP10A升高了2.

11、9倍(P<0.05)；ZNF264升高了4.2倍(P<0.05)。
　　 2.兩株hPES細胞與hBES細胞比較,除ATP10A、ZNF264外其它25個母本基因轉(zhuǎn)錄水平無統(tǒng)計學意義的差異。
　　 3.兩株hPES系細胞間比較,所檢測的27個母本基因的表達水平無統(tǒng)計學意義差異。
　　 4.與hBES比較,38個父本基因中15個基因:PEG10,MAGEL2,NDN,KCNQ1OT1,SNORD109A,SNRPN

12、,SNURF,SNORD107,SNORD64,SNORD108,SNORD109B,ZIM2,PEG3,IPW和PSIMCT-1轉(zhuǎn)錄水平在hPES1和hPES2中均表現(xiàn)為明顯下降或失活。
　　 5.與hBES比較,hPES1中SGCE的表達水平無統(tǒng)計學意義差異,hPES2中SGCE轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)1.8倍(P<0.05)。
　　 6.與hBES比較,其它23個父本基因在兩株hPES中的轉(zhuǎn)錄水平均無統(tǒng)計學意義差異。
　

13、　 7.兩株hPES細胞之間檢測的38個父本基因表達水平無統(tǒng)計學意義差異。
　　 8.在未分化hBES中,父源表達的INPP5F、KCNQ1OT1和NNAT,其轉(zhuǎn)錄水平與hBES傳代次數(shù)顯著相關(guān)；其余62個印記基因表達水平與hBES傳代次數(shù)無相關(guān)關(guān)系。
　　 9.比較50代前后的hBES細胞中印記基因表達水平,CALCR、PEG10、INPP5F、KCNQ1OT1的表達水平在50代后明顯下降,P<0.05；而NNAT在

14、50代后的hBES中表達水平明顯升高,P<0.01。其余60個印記基因在50代前后的細胞中均無明顯變化。
　　 10.hPES1中SNURF表達水平與傳代次數(shù)正相關(guān)(r2=.8497,P<0.05)；CDKN1C在hPES2中與傳代次數(shù)呈正相關(guān)(r2=.8796,P<0.05)。hPES1中除SNURF外其余64個印記基因、hPES2中除CDKN1C外其余64個印記基因表達水平與傳代次數(shù)無相關(guān)關(guān)系。
　　 11.6個基因

15、(TCEB3C,PRIM2,MESTIT1,PEG10,SNRPN,SANG)在50代后的hPES1細胞中出現(xiàn)明顯上升,其余59個印記基因在50代前后的hPES2細胞中均無明顯變化；而在hPES2中,僅僅CDKN1C在50代后的細胞中出現(xiàn)變化,上調(diào)2.0倍(P<0.05),其余64個印記基因在50代前后的hPES2細胞中均無明顯變化。
　　 12.hPES1和hPES2在體外培養(yǎng)70代以后,核型出現(xiàn)了變化,包括X染色體丟失,及平

16、衡異位。
　　 結(jié)論：
　　 1.hPES細胞中絕大部分(93.0％)母本基因、超半數(shù)(hPES1:58.3％；hPES2:55.6％)父本基因正常表達,說明hPES細胞比預(yù)想(母本基因雙倍表達,父本基因缺失)有更多的印記安全性。
　　 2.hPES與hBES間的主要差異是hPES1中15個、hPES2中16個父本基因的下調(diào)或失活。這些父本基因的異常表達可能是hPES細胞的主要印記缺陷。
　　 3.無論h

17、PES還是hBES,在體外培養(yǎng)過程中,絕大部分印記基因的表達維持穩(wěn)定。
　　 4.hPES1與hPES2的印記狀態(tài)并不完全一致,可能與體外長期培養(yǎng)有關(guān)。
　　 5.hPES中印記基因的異常表達與染色體核型無關(guān)。
　　 第二部分早期體外分化人類孤雌胚胎干細胞與人類受精胚胎干細胞的印記基因表達狀態(tài)比較
　　 研究目的：
　　 1.探討印記基因在hBES早期分化階段的表達變化。
　　 2.探討印

18、記基因在hPES早期分化階段的表達變化,明確在未分化hPES中探及的差異表達印記基因,在hPES細胞向胚體方向分化時有無修正。
　　 3.分析hPES與hBES在體外早期分化階段印記基因變化的差異。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗設(shè)計:選擇所有目前在人類中有明確印記狀態(tài)(母源或父源表達)的基因,參見http://WWW.geneimprint.com；http://WWW.otago.ac.nz,共65個印記

19、基因,其中父源表達(父本)基因27個,母源表達(母本)基因38個。實驗材料:實驗組1:hPES1分化第14天的胚體,對照組1:hPES1未分化細胞；實驗組2:hPES2分化第14天胚體,對照組2:hPES2未分化細胞；實驗組3:hBES分化第14天胚體,對照組3:未分化hBES。
　　 2.3株人類胚胎干細胞系均培養(yǎng)于小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse embryofibroblasts,MEFs)飼養(yǎng)層上,按標準的人類胚胎干細胞培

20、養(yǎng)方法進行培養(yǎng),在細胞傳代至p27、p37、p47代時,將細胞分為兩份,一份用于收集并提取總RNA,另一份hES細胞用膠原酶孵育,分離,懸浮培養(yǎng)于干細胞分化培養(yǎng)液中形成胚體達14天,取分化第14天的胚體,提取總RNA。
　　 3.對提取的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用PCR array的方法,進行SYBR Green實時定量PCR。
　　 4.測定hBES體外分化第14天胚體中印記基因表達狀態(tài)并與分化前比較。
　　

21、 5.分別測定2株hPES體外分化第14天胚體中印記基因表達水平,并與分化前比較。
　　 6.在每個研究組中用Ontology analysis的方法對分化前后差異表達的基因進行基因功能分析。
　　 7.比較hPES1、hPES2、hBES細胞分化前后基因變化的異同點。
　　 結(jié)果：
　　 1.與未分化hBES比較,在hBES體外分化14天的胚體中,有5個母源表達(SL,C22A2,SLC22A3,CO

22、PG2IT1,H19和CPA4),和1個父源表達的印記基因IGF2明顯上調(diào)。其余印記基因在hBES的EB形成過程中未發(fā)生明顯變化。
　　 2.在hPES1來源的胚體中,6個基因(SLC22A2,SLC22A18,CPA4,H19和WT1)表達水平明顯升高而1個基因:DLGAP2表達水平明顯下降。其余58個印記基因在hPES1的EB形成過程中未發(fā)生明顯變化。
　　 3.在hPES2來源的胚體中,7個印記基因(SLC22A2

23、,CPA4,H19,SLC22A18,OSBPL5,GNAS and IGF2)上調(diào),而2個印記基因(DLGAP2和INPP5F)下調(diào)。其余56個印記基因在hPES2的EB形成過程中未發(fā)生明顯變化。
　　 4.在hBES來源EB中,與未分化hBES細胞比較,差異表達印記基因的基因功能分析顯示:這些基因富于離子連接、離子轉(zhuǎn)運及染色質(zhì)重塑功能。
　　 5.在hPES來源EB形成中,與未分化hPES比較,差異表達印記基因的基因

24、功能分析顯示:這些基因富于離子連接、離子轉(zhuǎn)運及生物調(diào)節(jié)功能。
　　 6.SLC22A2,SLC22A18(or SLC22A3),CPA4,H19和IGF2無論在hBES還是在hPES細胞的早期分化中均出現(xiàn)明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.印記基因H19,IGF2,SLC22A2,SLC22A3/SLC22A18和CPA4的表達與人類胚胎干細胞早期分化發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　 2.在早期分化階段,hBES與

25、hPES的印記基因表達水平變化非常類似。
　　 3.在未分化hPES中高表達的母本基因與低表達的父本基因在hPES分化為胚體后沒有發(fā)生明顯變化。
　　 第三部分人類孤雌胚胎干細胞和人類雙親胚胎干細胞的印記基因DNA甲基化狀態(tài)比較
　　 研究目的：
　　 1.探討hBES中4個印記基因差異甲基化區(qū):(SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1)甲基化狀態(tài)及其在體外

26、長期培養(yǎng)傳代后的變化。
　　 2.分析hPES中4個印記基因差異甲基化區(qū)甲基化狀態(tài)及其在體外長期培養(yǎng)傳代后的變化。
　　 3.比較hPES與hBES中4個印記基因的差異甲基化區(qū)甲基化狀態(tài)的差異。
　　 4.探討印記基因的差異甲基化區(qū)甲基化水平在hBES早期分化階段的變化。
　　 5.分析印記基因的差異甲基化區(qū)甲基化水平在hPES早期分化階段的變化。
　　 6.探討hPES及受精胚胎干細胞中印記基因

27、表達水平與差異甲基化區(qū)甲基化水平之間的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1.實驗設(shè)計:根據(jù)第一、第二部分的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)hPES1和hPES2中分別有15/16個父本基因表達水平異常。我們選擇了4個與這些父本基因相關(guān)的印記調(diào)控中心-差異甲基化區(qū):SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1,測定其甲基化水平。實驗樣本:未分化hBES,p27；未分化hBES,p77；未分化hPES

28、1,p27；未分化hPES1,p77；未分化hPES2,p27；未分化hPES2,p77;hBES來源EB；hPES1；來源EB；hPES2來源EB。
　　 2.3株人類胚胎干細胞系均培養(yǎng)于小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse embryofibroblasts,MEFs)飼養(yǎng)層上,按標準的人類胚胎干細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。自早代(p27)、晚代(p77),各取一次細胞,提取基因組DNA。將hES細胞用膠原酶孵育,分離,懸浮培養(yǎng)于干細胞

29、分化培養(yǎng)液中形成胚體達14天,取分化第14天的胚體,提取基因組DNA。
　　 3.對提取的基因組DNA行重硫酸鹽處理、克隆、測序,分析差異甲基化區(qū)SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平。
　　 4.比較3組間印記基因的差異甲基化區(qū)SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平的差異。
　　 5.比較每組

30、中早代及晚代未分化細胞之間差異甲基化區(qū)的甲基化水平差異。
　　 6.比較每組中分化前后細胞差異甲基化區(qū)的甲基化水平差異。
　　 7.分析差異甲基化區(qū)SNRPN-SNURF、ZIM2/PEG3、SGCE/PEG10 DMR及KVDMR1的甲基化水平與相應(yīng)基因mRNA表達水平之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.hBESC早代及晚代細胞中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2、SNURF-SN

31、RPN DMR均顯示嚴格的半數(shù)甲基化。
　　 2.在hPES1早代及晚代細胞中,3個差異甲基化區(qū):KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均顯示為重度甲基化狀態(tài),其甲基化水平較hBESC明顯增高。
　　 3.在hPES2早代及晚代細胞中,3個差異甲基化區(qū):KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均顯示為重度甲基化狀態(tài),其甲基化水平較hBESC明顯增高。
　　 4.h

32、BESC分化第14天的胚體中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR均顯示嚴格的半數(shù)甲基化。
　　 5.在hPES1及hPES2來源第14天的胚體中差異甲基化區(qū):KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR均顯示為重度甲基化狀態(tài)。
　　 6.hPES1早代、晚代、分化第14天胚體中SGCE DMR顯示明顯去甲基化；hPES2早代、晚代、分化第14天胚體中S

33、GCEDMR為輕度去甲基化。
　　 結(jié)論：
　　 1.hBESC中KVDMR1,SGCE/PEG10,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR均為正常的等位基因特異性基化狀態(tài),在hBESC體外長期傳代及向胚體方向分化時正常甲基化狀態(tài)維持不變。
　　 2.2株hPESC中KVDMR1,PEG3/ZIM2,SNURF-SNRPN DMR維持了母源甲基化狀態(tài),3個DMRs的重度甲基化狀態(tài)在hPESC長期傳代及

34、向胚體方向分化時維持不變。
　　 3.兩株hPESC中KVDMR1,PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMRs的重度甲基化狀態(tài)是導致相應(yīng)父本基因靜默或下調(diào)的可能因為。
　　 4.hPESC中SGCE/PEG10的去甲基化是SGCE在hPESC中激活甚至正常表達的可能因為。
　　 5.KVDMR1,SGCE/PEG10、PEG3/ZIM2、SNURF-SNRPN DMR的DNA甲基化可能是hPESC中相應(yīng)