異常核型人類胚胎干細(xì)胞向腫瘤演進(jìn)的初步研究.pdf

1、第一章異常核型人類胚胎干細(xì)胞的鑒定及細(xì)胞遺傳學(xué)的分析。 目的：檢測(cè)異常核型人類胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)特性并探索隨著傳代的進(jìn)行，染色體發(fā)生改變的規(guī)律。 方法：對(duì)人類胚胎干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，每5-10代進(jìn)行染色體的分析，通過(guò) G 顯代、比較基因組雜交及原位雜交技術(shù)檢測(cè)并確定細(xì)胞核型。對(duì)實(shí)驗(yàn)采用異常核型人類胚胎干細(xì)胞株chHES<,3>進(jìn)行三個(gè)方面的檢測(cè)，胚胎干細(xì)胞的未分化特性，如胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記，堿性磷酸酶

2、(AKP)活性：體內(nèi)外分化能力檢測(cè)，如擬胚體形成能力，胚層相關(guān)基因表達(dá)，體內(nèi)畸胎瘤形成等。 結(jié)果：異常核型的人類胚胎干細(xì)胞染色體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在早期的變異中(P34)，表現(xiàn)為單一的核型，核型為46,XX,dup(1)(p32pter)；傳代到P44-P99時(shí)，核型日益復(fù)雜無(wú)序，出現(xiàn)累及多條染色體的結(jié)構(gòu)重排和復(fù)雜的重排，代基礎(chǔ)上X三體重新變成X二體。異常人類胚胎干細(xì)胞(chHESC3)生物學(xué)特性均符合國(guó)際胚胎干細(xì)胞建系標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞表達(dá)S

3、SEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、Oct4 等胚胎干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，AKP染色呈陽(yáng)性;掃描電子顯微鏡觀察，相對(duì)正常核型的HES細(xì)胞，異常核型的HES細(xì)胞質(zhì)內(nèi)擁有更發(fā)達(dá)的細(xì)胞器結(jié)構(gòu);chHESC3 脫離飼養(yǎng)層細(xì)胞后在含有血清替代物的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)能夠形成擬胚體，對(duì)擬胚體進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：擬胚體表達(dá)內(nèi)、中、外胚層的標(biāo)志基因如 AFP、tansferrin、KDR、nestin、SOXl 等，而全能性相關(guān)基因nanog

4、、oct4表達(dá)明顯下調(diào);異常核型的人類胚胎干細(xì)胞注射到SCID鼠大腿體內(nèi)形成畸胎瘤，包含有來(lái)源于三個(gè)胚層的細(xì)胞。 結(jié)論：正常與異常核型chHESCs-3細(xì)胞株仍保持未分化狀，具有多能性;異常核型的人類胚胎干細(xì)胞具有正常人類胚胎干細(xì)胞的特征，也是一種胚胎性細(xì)胞;核型的改變符合腫瘤染色體變化的規(guī)律。 第二章異常核型的人類胚胎干細(xì)胞表型特征。 目的：研究異常核型的人類胚胎干細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)表型特征。 方法：采

5、用在亞優(yōu)化培養(yǎng)條件下，觀察正常核型、異常核型的人類胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)狀況；檢測(cè)正常核型、異常核型人類胚胎干細(xì)胞細(xì)胞周期的分布；檢測(cè)正常、異常核型人類胚胎干細(xì)胞細(xì)胞凋亡率；檢測(cè)體外形成單克隆能力；檢測(cè)正常核型、異常核型胚胎干細(xì)胞細(xì)胞群落中不同亞群分布；生物信息學(xué)分析單純一號(hào)染色體重復(fù)區(qū)域與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、腫瘤演進(jìn)相關(guān)基因并進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果:在亞優(yōu)化培養(yǎng)條件下，正常核型的人類胚胎干細(xì)胞分化嚴(yán)重，具有很高的分化比例，但是異常核

6、型的人類胚胎干細(xì)胞細(xì)胞在克隆的邊緣或中央較容易保持未分化狀態(tài)；正常核型的人類胚胎干細(xì)胞細(xì)胞周期中 S 期細(xì)胞的比例為 34.12±0.8054％；在復(fù)雜核型異常組早期(P70-110)S期細(xì)胞所占的百分比為35．08±3．96％，G1期細(xì)胞則是52．16±8．38％。在復(fù)雜核型組晚期(P120-180)，S期細(xì)胞所占的百分比是47．6±7．54％，而G1期細(xì)胞比例下降至37．2±3．09％，隨著傳代次數(shù)的增加，S期細(xì)胞在細(xì)胞周期中所占的

7、比例變得越來(lái)越高。 結(jié)論：異常核型的人類胚胎干細(xì)胞具有更強(qiáng)的保持未分化能力、具有更強(qiáng)的自我更新的能力、更強(qiáng)的抗凋亡能力；正常核型的HES細(xì)胞與異常核型的HES細(xì)胞群落中存在著明顯的異質(zhì)性，處在原始干細(xì)胞不同發(fā)育的階段。 第三章異常核型的人類胚胎干細(xì)胞向腫瘤演進(jìn)的表型。 目的：比較正常核型、復(fù)雜核型人類胚胎干細(xì)胞和EC細(xì)胞致瘤的差別，評(píng)估異常核型的人類胚胎干細(xì)胞體內(nèi)致瘤能力。 方法：通過(guò)畸胎瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)M異常核

8、型的人類胚胎干細(xì)胞向腫瘤演進(jìn)的過(guò)程。將異常核型的人類胚胎干細(xì)胞分為三組：1)核型正常組；2)核型變異組(復(fù)雜核型)；3)畸胎癌干細(xì)胞組；取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的人類胚胎干細(xì)胞注射入嚴(yán)重免疫缺陷小鼠后退肌肉內(nèi)，觀察腫瘤大小，監(jiān)測(cè)小鼠的體重隨時(shí)間的關(guān)系，10周后處死SCID鼠，制備組織切片，HE染色后光鏡下觀察細(xì)胞的組織形態(tài)，原始神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)，并與臨床的畸胎瘤標(biāo)本進(jìn)行比較；不同發(fā)育時(shí)間正常核型人類胚胎干細(xì)胞致畸胎瘤標(biāo)本的比較；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)畸胎

9、瘤中各分子的表達(dá)情況。 結(jié)果：異常核型的人類胚胎干細(xì)胞形成的瘤組織內(nèi)可見(jiàn)數(shù)量不等的三個(gè)胚層衍化的組織：分化程度為未成熟、欠成熟和完全成熟的瘤組織，各胚層瘤組織成份互相摻雜，可見(jiàn)分化成熟的骨、軟骨組織、鱗狀上皮、腺上皮、肝臟組織等，而分化不成熟的間葉組織及神經(jīng)組織較多。 結(jié)論：異常核型的人類胚胎干細(xì)胞所致的畸胎瘤為不成熟畸胎瘤Ⅲ級(jí)，瘤體內(nèi)存在很多未分化完全的組織和細(xì)胞，具有干細(xì)胞的特征，具有高增殖的潛能，具有向腫瘤、腫瘤干

10、細(xì)胞演進(jìn)的趨勢(shì)。 第四章異常核型的人類胚胎干細(xì)胞向腫瘤演進(jìn)分子機(jī)制的初步探討。 目的：分析異常核型的人類胚胎干細(xì)胞向腫瘤演進(jìn)的分子機(jī)制 方法：收集正常核型，1 號(hào)染色體重復(fù)的、復(fù)雜核型的人類胚胎干細(xì)胞及畸胎癌細(xì)胞四種樣本，通過(guò)基因芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜的分析，對(duì)表達(dá)差異基因進(jìn)行了染色體的定位分析和各染色體上表達(dá)率的分析，對(duì)具有表達(dá)差異的基因進(jìn)行了生物學(xué)功能的分析、聚類分析及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的分析。 結(jié)果：比較了正

11、常核型的chHES-20(P11)，1 號(hào)染色體異常的chHES-3 (P72)，復(fù)雜核型的 chHES-3 (P182)和人胚胎癌細(xì)胞(NTERA-2)的基因表達(dá)譜。在芯片的20387個(gè)基因中，以上四個(gè)樣本分別有12378、11001、11375和11096個(gè)基因表達(dá)，相對(duì)于其他三組來(lái)說(shuō)，正常核型的人類胚胎干細(xì)胞表達(dá)較多的基因，而其他三組細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)目相差不大。通過(guò)分析，正常核型的HES中有1176個(gè)基因特異的表達(dá)，1號(hào)染色體異常的

12、HES中有280個(gè)基因特異表達(dá)，而復(fù)雜核型的HES中有359個(gè)基因特異表達(dá)。由于1號(hào)染色體短臂的重復(fù)是所有異常核型chHES-3細(xì)胞的共同特點(diǎn)，為了了解染色體的變化是否與基因的表達(dá)存在一定的關(guān)系，我們把在三個(gè)HES中表達(dá)的差異基因利用 Visual inspection and initial statistical軟件進(jìn)行了染色體的定位分析。1 號(hào)染色體異常的HES相對(duì)于正常核型而言，共有629個(gè)上調(diào)的基因，其中84個(gè)主要集中在1號(hào)染

13、色體短臂，特別是在1p32-36區(qū)域內(nèi)，占13.35％。而發(fā)現(xiàn)的2504個(gè)下調(diào)基因則平均分散在所有的染色體上。復(fù)雜核型的HES細(xì)胞相對(duì)于正常核型的髓S細(xì)胞來(lái)說(shuō)，有1285個(gè)基因上調(diào)，其中有206個(gè)基因主要集中在1號(hào)染色體上，有117個(gè)基因在1P32-36區(qū)域內(nèi)，占9．1％；在全能性基因這一組，在所有樣本中都表達(dá)的，18個(gè)嚴(yán)格意義上的全能性相關(guān)基因及候選基因中，POU5F1、SOX2、Nanog、LDB2、GABRB3、FGFR4、LEF

14、TY2、DNMT3B、CD9 這九個(gè)基因漸進(jìn)性的升高。在21個(gè)外胚層發(fā)育相關(guān)的基因中，F(xiàn)N1、MS12、NEDD1、SEPT2、NEFH、NEDD4、PAX6、OTX2、MCFD2、SOX3這九個(gè)基因；在28個(gè)與中胚層發(fā)育相關(guān)的基因中，EOMES、FLT1、GATA2、HLA-C、KDR、LMO2、MYLA、PECAM1、PITX2、RUNX1、T、THBS1、THBS2、VCAM1這 14 個(gè)基因；在七個(gè)和內(nèi)胚層發(fā)育相關(guān)的基因中，AF

15、P、CER1、FOXA2、GATA4、GATA6 and HNF4A 這六個(gè)基因，它們都有下降的趨勢(shì)；在正常核性、異常核性與畸胎癌細(xì)胞中，我們?nèi)娴谋容^了重要信號(hào)傳導(dǎo)通路中分子的基因表達(dá)譜。在與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的差異基因中，在1號(hào)染色體異常的HES細(xì)胞和復(fù)雜核型的HES細(xì)胞中，效應(yīng)分子 GSK-3beta 有一個(gè)明顯的下降；比較了四個(gè)樣本中的 Hst(FGFR1)、MDM2、BCL2、LMO2、ERBB2、TPM3、NTRK1、MET