人孤雌胚胎干細(xì)胞X染色體失活狀態(tài)的研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(ES，Embryonic Stem cells)來(lái)自囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM，Inner CellMass)，以自我更新和多向分化潛能的特性在干細(xì)胞研究和應(yīng)用相關(guān)領(lǐng)域備受重視，人胚胎干細(xì)胞不僅為臨床上細(xì)胞移植、組織工程的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊前景，也是研究人類早期胚胎發(fā)生、細(xì)胞組織分化、基因表達(dá)調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)事件的理想模型之一。但其應(yīng)用的安全性尚存在眾多爭(zhēng)議。近年來(lái)研究表明：表觀遺傳學(xué)的改變多發(fā)生在胚胎早期，并且在發(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中

2、能穩(wěn)定傳遞，因此有越來(lái)越多的研究建議將表觀遺傳學(xué)各個(gè)方面的穩(wěn)定性納入胚胎干細(xì)胞的鑒定內(nèi)容之中。
　　 X染色體失活(XCI，X Chromosome Inactivation)是指哺乳動(dòng)物雌性胚胎中一對(duì)X染色體中的某一條在轉(zhuǎn)錄水平上的沉默，位于X染色體上的多達(dá)1000個(gè)基因沉默使雄性和雌性性別連鎖基因的表達(dá)量平衡，是哺乳動(dòng)物雌性個(gè)體維持劑量補(bǔ)償效應(yīng)的機(jī)制，也是表觀遺傳學(xué)研究重要組成部分。XCI的選擇和啟動(dòng)發(fā)生在囊胚期，由X失活中

3、心(XIC，X-Inactivation Center)控制。XIC中XIST基因(X Inactivation Specific Transcript)的缺失將導(dǎo)致XCI失敗。XCI的過(guò)程為：XIST基因編碼XIST-RNA，包裹在合成它的X染色體上，隨后不斷積累和擴(kuò)展，招募一些對(duì)基因沉默有意義的因子如PCG蛋白從而誘導(dǎo)DNA甲基化和組蛋白修飾的發(fā)生，這對(duì)于XCI的建立和維持有重要作用。而保留活性的X染色體表達(dá)TSIX RNA(XIS

4、T Antisense RNA)，抑制XIST的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 XCI狀態(tài)在不同的女性人胚胎干細(xì)胞系中存在差異。Dhara和Benvenisty報(bào)道，在未分化的女性人胚胎干細(xì)胞中，兩條X染色體都是有活性的，但是Hall等人的研究發(fā)現(xiàn)在未分化的人胚胎干細(xì)胞中，也存在著XCI的現(xiàn)象，研究結(jié)果的不同可能足由不同系和同系的亞代之間差異產(chǎn)生的，而胚胎干細(xì)胞系之間不同的表觀遺傳狀態(tài)也反映了其來(lái)源的胚胎質(zhì)量、胚胎年齡以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離技術(shù)和長(zhǎng)

5、期傳代培養(yǎng)的環(huán)境之間的差異?，F(xiàn)已建立的多株人胚胎干細(xì)胞系雖然都證實(shí)其特異性標(biāo)志物的表達(dá)，但其XCI狀態(tài)的不同可能會(huì)對(duì)這些細(xì)胞系的表觀遺傳特征產(chǎn)生影響，特別是可能導(dǎo)致發(fā)育早期的一些調(diào)控過(guò)程的改變。
　　 孤雌激活人卵母細(xì)胞是利用電化學(xué)方法，通過(guò)提高胞漿內(nèi)鈣離子濃度、抑制第二極體排出保證胚胎染色體為二倍體，在其發(fā)育成囊胚后通過(guò)分離ICM建立核型為(46，XX)的孤雌人胚胎干細(xì)胞系。雖然其核型與正常女性相同，但其兩條X染色體都是母源性

6、的，是否也存在XCI現(xiàn)象?其XCI的狀態(tài)與正常的女性人胚胎干細(xì)胞足否相同?目前尚缺乏研究回答以上問(wèn)題。
　　 本研究利用我中心實(shí)驗(yàn)室建立的兩株人卵母細(xì)胞孤雌激活形成的胚胎干細(xì)胞系作為研究對(duì)象，探求未分化的人孤雌胚胎干細(xì)胞(hPESCs，humanParthenogenetic Embryonic Stem Cells)的X染色體失活狀態(tài)，觀察一系列XCI標(biāo)記物在其早、中、晚代培養(yǎng)過(guò)程中的表達(dá)情況，并與雙親來(lái)源的女性人胚胎干細(xì)胞(

7、hESCs，human Embryonic Stem Cells)進(jìn)行比較，同時(shí)也初步研究了人孤雌胚胎干細(xì)胞與雙親來(lái)源的女性人胚胎干細(xì)胞在X-連鎖基因單核苷酸多態(tài)性(SNP，Single Nucleotide Polymorphism)位點(diǎn)的表達(dá)狀況。
　　 第一部分、人孤雌胚胎干細(xì)胞X染色體失活標(biāo)記物表達(dá)的分析
　　 目的：
　　 研究未分化的人孤雌胚胎干細(xì)胞X染色體失活(XCI)狀態(tài)，觀察一系列XCI標(biāo)記物在

8、其早、中、晚代培養(yǎng)過(guò)程中的表達(dá)情況，并與雙親來(lái)源的女性人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行比較。
　　 材料：
　　 選擇女性子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(ESCs，Endometrial Stromal Cells)作為XCI的陽(yáng)性對(duì)照模型，男性包皮成纖維細(xì)胞(HFFs，Human Foreskin Fibroblasts)作為XCI的陰性對(duì)照模型，實(shí)驗(yàn)組中共有三株已經(jīng)過(guò)鑒定的人胚胎干細(xì)胞，其中兩例為卵母細(xì)胞孤雌激活形成的入胚胎干細(xì)胞hPESCs-1

9、和hPESCs-2，另一例為IVF雙親來(lái)源的女性人胚胎干細(xì)胞hESCs。
　　 方法：
　　 在這五個(gè)細(xì)胞系中，分別進(jìn)行了染色體核型、XIST-DNA和X-著絲粒的熒光原位雜交、XIST和TSIX實(shí)時(shí)熒光定量PCR、XIST-RNA熒光原位雜交、組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3，Histone H3 Lysine27 Trimethylation)免疫熒光及Barr小體染色等檢測(cè)，并將三株人胚胎干細(xì)胞早

10、、中、晚代次的XIST和TSIX基因的表達(dá)情況、H3K27me3狀況和Barr小體陽(yáng)性率分別同陽(yáng)性模型ESCs進(jìn)行了比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.陽(yáng)性對(duì)照模型ESCs的XCI標(biāo)記物明顯：包括兩條X染色體著絲粒附近存在X染色體失活中心上的XIST基因、細(xì)胞中表達(dá)XIST基因、XIST-RNA和H3K27me3在細(xì)胞中呈一團(tuán)狀聚集、Barr小體陽(yáng)性率為20.33％等，而陰性對(duì)照模型HFFs中缺乏XCI標(biāo)記物。
　　

11、 2.兩株人孤雌胚胎干細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中維持正常核型，兩條X染色體上都存在XIST基因，且在早、中、晚代次中保持一致。
　　 3.兩株人孤雌胚胎干細(xì)胞與雙親來(lái)源的女性人胚胎干細(xì)胞hESCs中的XCI標(biāo)記物狀態(tài)相似，表現(xiàn)為：XIST基因均為低水平表達(dá)；XIST-RNA熒光原位雜交結(jié)果與之相符，在克隆團(tuán)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)明顯的XIST-RNA團(tuán)狀聚集；細(xì)胞中H3K27me3呈散在分布，未形成積聚狀態(tài)；早、中、晚各代次的三株人胚胎干細(xì)

12、胞Barr小體陽(yáng)性率明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組ESCs，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 4.隨著體外培養(yǎng)代次的增加，實(shí)驗(yàn)組三株人胚胎細(xì)胞的XIST表達(dá)量明顯上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但都顯著低于陽(yáng)性對(duì)照模型(P＜0.001)；hPESCs-1在第35代、65代及95代的XIST表達(dá)量分別高于相應(yīng)代次的hPESCs-2和hESCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.五個(gè)細(xì)胞系均表達(dá)TSIX

13、基因，除第95代的hPESCs-1和第35代的hPESCs-2外，其他各株細(xì)胞TSIX的表達(dá)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組三株人胚胎干細(xì)胞中TSIX的表達(dá)量隨體外培養(yǎng)代次的增加發(fā)生變化，相同細(xì)胞系在不同代次之間TSIX表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；陽(yáng)性對(duì)照模型ESCs中XIST與TSIX表達(dá)量的比值為14491.61，顯著高于實(shí)驗(yàn)組。
　　 6.實(shí)驗(yàn)組三株人胚胎干細(xì)胞隨著體外培

14、養(yǎng)代次的增加，三株人胚胎干細(xì)胞的Barr小體陽(yáng)性率均升高，每株胚胎干細(xì)胞早、中、晚各代次之間Barr小體陽(yáng)性率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；處于早、中、晚各代次時(shí)，三株人胚胎干細(xì)胞之間Barr小體陽(yáng)性率的差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 第二部分、人孤雌胚胎干細(xì)胞和女性人胚胎干細(xì)胞中X-連鎖基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)表達(dá)狀況的初步分析
　　 目的：
　　 初步研究了人孤雌胚胎干細(xì)胞X-連鎖基因SN

15、P位點(diǎn)表達(dá)狀況，并與雙親來(lái)源的女性人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行比較。
　　 材料：
　　 與第一部分相同
　　 方法：
　　 1.DNA測(cè)序：在GeneBank上查找X染色體連鎖的相關(guān)基因序列及其中的SNP位點(diǎn)，根據(jù)具體位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物，提取細(xì)胞DNA并進(jìn)行擴(kuò)增、純化DNA后用測(cè)序儀測(cè)序、應(yīng)用軟件分析測(cè)序結(jié)果，確定雜合的SNP位點(diǎn)。
　　 2.cDNA測(cè)序：針對(duì)DNA測(cè)序結(jié)果中雜合的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成引物，提

16、取細(xì)胞RNA，行逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的擴(kuò)增，純化cDNA后測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1.DNA測(cè)序結(jié)果：通過(guò)對(duì)所選X連鎖基因上的14個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，陰性對(duì)照組HFFs所有測(cè)序位點(diǎn)均為純合，陽(yáng)性對(duì)照組ESCs和實(shí)驗(yàn)組三株人胚胎干細(xì)胞中存在部分雜合位點(diǎn)。
　　 2.在ESCs中有5個(gè)雜合位點(diǎn)，分別為POLA1-rs929313、CXORF22-rs4412518、CXORF22-rs7350355

17、、ATP7A-rs2227291和HS6ST2-rs5933220;在hESCs中有6個(gè)雜合位點(diǎn)，分別為POLA1-rs929313、GK-rs6526997、DMD-rs228406、HS6ST2-rs5933220、CXORF12-rs2266890和CXORF12-rs7350355；hPESCs-1和hPESCs-2雜合位點(diǎn)相同，均為CXORF22-rs4412518和CXORF22-rs7350355。
　　 3.cD

18、NA測(cè)序結(jié)果：ESCs和hESCs中部分雜合位點(diǎn)呈等位基因雙表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在未分化的兩株人孤雌胚胎干細(xì)胞中，絕大多數(shù)細(xì)胞未發(fā)生X染色體失活，而同實(shí)驗(yàn)室建系的一株雙親來(lái)源的女性人胚胎干細(xì)胞也具備兩條有活性的X染色體，且在X-連鎖基因的雜合位點(diǎn)呈雙等位基因表達(dá)。
　　 2.隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的增加，X染色體失活標(biāo)記物在人孤雌胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)有所上升，但遠(yuǎn)未能達(dá)到正常女性體細(xì)胞中X染色體失活狀態(tài)的水平