X染色體失活研究與女性缺血性卒中誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞系的建立.pdf

1、【研究背景】：
　　卒中嚴(yán)重降低了人類(lèi)的生活質(zhì)量，并給社會(huì)帶來(lái)了惡劣的影響，缺血性腦卒中為最常見(jiàn)的病發(fā)類(lèi)型。相比之下，女性的生命周期較長(zhǎng)，因此女性的腦卒中發(fā)病比例要高于男性，專(zhuān)家預(yù)測(cè)，截止到2050年，腦卒中的發(fā)病率女性將比男性高出三十個(gè)百分點(diǎn)。同時(shí)，女性獨(dú)特的生理因素，導(dǎo)致中老年的女性發(fā)生卒中后，社會(huì)活動(dòng)能力更差，個(gè)人生活更加困難。
　　隨著2003年人類(lèi)基因組測(cè)序工作的完成，世界各國(guó)科學(xué)家逐漸把注意力投入到遺傳學(xué)的研究，

2、而缺血性卒中與表觀遺傳學(xué)之間一直為熱點(diǎn)研究。其中，X染色體失活是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，并已經(jīng)證實(shí)與多種人類(lèi)疾病相關(guān)聯(lián)。X染色體失活包括傾斜性失活和隨機(jī)性失活，本課題將對(duì)比缺血性卒中患者與正常人群的X染色體失活情況，探索X染色體失活與女性缺血性卒中是否存在關(guān)聯(lián)，如果存在關(guān)聯(lián)，哪種失活與缺血性卒中的關(guān)聯(lián)性有意義，從而達(dá)到對(duì)女性缺血性卒中的危險(xiǎn)因素的研究及預(yù)防目的。
　　在研究X染色體失活與缺血性卒中的同時(shí)，選取一例伴有家族史卒中史

3、且已證實(shí)X染色體隨機(jī)性失活的缺血性卒中女性患者的血液，從外周淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞，并研究細(xì)胞誘導(dǎo)前后的X染色體失活情況。
　　【目的】：
　　1.X染色體傾斜性失活與女性缺血性腦卒中的相關(guān)性研究。
　　2.建立女性缺血性卒中的誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞系,為闡述缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制、臨床治療及藥物篩選做鋪墊。
　　3.誘導(dǎo)前后的X染色體失活狀態(tài)研究。
　　【方法】：
　　1.收集女性缺血性腦卒中新發(fā)病例組及

4、健康對(duì)照組外周血標(biāo)本各60例，從血液標(biāo)本中進(jìn)行DNA提取，運(yùn)用基因片段方法對(duì)其進(jìn)行雜純合子分析。在雜合子人群中，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的樣本行甲基化處理，隨后對(duì)其MS-PCR，最后，運(yùn)用ABI3100基因分析儀判斷失活類(lèi)型。
　　2.使用含四因子的仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染人外周血淋巴細(xì)胞,建立誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(human peripheral blood mononuclear cells induced pluripotent stem ce

5、lls， hPBMC-iPSCs),并且從基因表達(dá)、體內(nèi)分化能力和分化核型等不同方面進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)hPBMC-iPSCs提取DNA，并運(yùn)用方法1，對(duì)其失活狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。
　　【結(jié)果】：
　　1.女性缺血性卒中組和健康人群組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩者基因的純合子發(fā)生率近似，而X染色體傾斜性失活卒中組明顯升高。
　　2.建立了1株女性缺血性卒中的hPBMC-iPSCs，所建立的hPBMC-iPSCs在體外能維持自我更新和多能性的狀態(tài),可

6、表達(dá)多能標(biāo)志基因,在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)能維持正常核型，在體內(nèi)、體外均可向三個(gè)胚層分化。
　　3.誘導(dǎo)后的多潛能干細(xì)胞由誘導(dǎo)前的X染色體隨機(jī)失活變?yōu)閮A斜性失活。
　　【結(jié)論】：
　　1.女性缺血性卒中發(fā)病率與X染色體傾斜性失活有明顯關(guān)聯(lián)性，為預(yù)測(cè)女性卒中的發(fā)生提供了相關(guān)證據(jù)。
　　2.以四因子作為誘導(dǎo)基因，通過(guò)仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)錄技術(shù)，成功將人外周血中淋巴細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞。
　　3.對(duì)iPS的生物學(xué)鑒定顯示，iP