維持人胚胎干細(xì)胞不分化的鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化操作的建立與殘留的絲裂霉素C對(duì)人胚胎干細(xì)胞基因組穩(wěn)定性影響的研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞（humanembryonicstemcells，hEScells）是一種從人類早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的多能性干細(xì)胞。一方面，它能在體外特定的環(huán)境下保持不分化的狀態(tài)并且無限擴(kuò)增。另一方面，在特殊的誘導(dǎo)條件下，它又能分化成特定的組織細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，胰島素分泌細(xì)胞，心肌細(xì)胞和造血細(xì)胞等，成為神經(jīng)退行性疾病，糖尿病，心肌梗塞和血液疾病等疑難疾病的細(xì)胞替代治療的重要細(xì)胞來源。 上世紀(jì)60年代開始到90年代末，小鼠，靈

2、長類等哺乳動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞陸續(xù)建系成功。在此基礎(chǔ)上，1998年，美國Thomson等建立了第一個(gè)人胚胎干細(xì)胞系，于是，研究開發(fā)這種具有巨大臨床應(yīng)用前景的生物資源，立即成為生物醫(yī)學(xué)界最具吸引力的熱門領(lǐng)域。但是，由于人胚胎干細(xì)胞取自人類早期發(fā)育胚胎，因此受到倫理道德方面的質(zhì)疑，研究也一度受到限制，發(fā)展受到制約。2009年初，美國食品藥品監(jiān)督管理部門（Foodanddrugadministration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了第一例利用人胚胎干細(xì)胞治療

3、脊髓損傷的臨床治療試驗(yàn)，隨著這一臨床治療試驗(yàn)的獲批，人胚胎干細(xì)胞的研究將又一次成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的熱潮，而相應(yīng)的倫理規(guī)范也將進(jìn)一步完善，為胚胎干細(xì)胞的研究提供依據(jù)與支持。 本課題組所在的研究所從2001年開始人胚胎干細(xì)胞的建系和培養(yǎng)工作，并于2002年成功建立人胚胎干細(xì)胞系。但是在課題研究之初，維持人胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的環(huán)境是很不穩(wěn)定的，出現(xiàn)大量分化，甚至大量死亡的現(xiàn)象。人胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的體系較其它細(xì)胞嚴(yán)苛和復(fù)雜，需要事先制

4、備一層有絲分裂滅活的飼養(yǎng)層細(xì)胞作為支持，然后才能進(jìn)行傳代。傳代后的培養(yǎng)需每天更換添加了各種因子的培養(yǎng)基，直到六天后下一個(gè)傳代日的到來再重復(fù)上述過程。一般來說，這一層有絲分裂滅活的飼養(yǎng)層細(xì)胞是鼠胚胎成纖維細(xì)胞，它取材比較方便，不存在倫理學(xué)爭議，但是操作步驟繁雜，而且這種細(xì)胞分裂次數(shù)有限，每個(gè)批次的細(xì)胞用完都必需重新制備。本課題的研究就是從標(biāo)準(zhǔn)化鼠源性飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備入手，分析造成人胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境不穩(wěn)定的因素，探討人胚胎干細(xì)胞體外培

5、養(yǎng)的安全性問題，為人胚胎干細(xì)胞臨床應(yīng)用提供安全穩(wěn)定的種子細(xì)胞。本文共包括兩大部分： 第一部分：標(biāo)準(zhǔn)化鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，mEFs）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞（feeder cells）的操作程序。利用Microsoft office中的Access軟件，建立小型管理數(shù)據(jù)庫。 第二部分：探討絲裂霉素C對(duì)人胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)的毒性影響。試圖揭示人胚胎干細(xì)胞體外核型變化以及DNA損傷修