包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的二倍體小鼠孤雌胚胎干細胞的分離和肌肉損傷修復模型的建立.pdf

1、在缺少雄性配子基因組的情況直接激活成熟卵子能夠形成孤雌囊胚，從這個孤雌囊胚中可以分離得到孤雌胚胎干細胞。孤雌胚胎干細胞的使用避開了倫理問題，可以為再生醫(yī)學提供種子細胞來源，在細胞移植、組織和器官重建方面具有廣闊的應用前景。但是與受精胚來源的胚胎干細胞相比，孤雌胚胎干細胞的發(fā)育潛能是非常有限的。造成這一結果的原因之一可能是父源性基因組的缺失。以往的報道證實未生長卵子(新生小鼠卵子)在多個印記基因表達模式上具有精子基因組的特點。本研究首次應

2、用基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術構建了包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的二倍體孤雌囊胚(NF-pBlastocysts)；首次建立了三株包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的孤雌胚胎干細胞系(NF-pES cells)。為了證明NF-pES細胞具有臨床治療價值，我們制造了小鼠肌肉損傷修復模型。結果顯示，NF-pES細胞能夠分化形成骨骼肌纖維，參與損傷肌肉的修復。 作為一個新型的孤雌胚胎干細胞，NF-pES細胞不僅在再生

3、醫(yī)學領域具有巨大的應用前景而且也提供了一個研究基因印記和器官發(fā)育相互關系的體外研究工具。NF-pES細胞的分離成功也為建立人類孤雌胚胎干細胞系提供了一個新的思路。 1．胚胎干細胞研究平臺的建立-----建立在絲裂霉素處理的胎兒成纖維細胞上的胚胎干細胞的分離與鑒定由于進口的絲裂霉素C屬國家管制藥品，難以購到而且市場報價較貴，所以我們選用國內知名生產商浙江海正藥業(yè)生產的國藥準字H33020786的絲裂霉素。實驗結果表明，當絲裂霉素

4、濃度為20μg/ml作用4h或30μg/ml作用2h、4h時，均可有效抑制細胞的分裂而不影響細胞活力。小鼠胎兒成纖維細胞經濃度為30μg/ml的絲裂霉素作用2h后制備飼養(yǎng)層，將7枚體內受精囊胚種植在該飼養(yǎng)層上，從中共獲得5個胚胎干細胞株。經鑒定，所有胚胎干細胞株都表達堿性磷酸酶活性，Oct-4和SSEA-1陽性，能夠形成具有三個胚層分化能力的畸胎瘤，其中一個細胞株具有生殖系嵌合能力。因此，浙江海正藥業(yè)生產的絲裂霉素不僅對小鼠胚胎成纖維細

5、胞的生長具有明顯的抑制作用，而且支持具有生殖系嵌合能力的ES細胞的分離。國產絲裂霉素價格低廉，大大降低了實驗成本，同時本研究也為國產藥品在ES細胞研究中的應用提供了試驗依據。 2．包含有未生長卵子(non-growing oocytes)和成熟卵子(fully grown oocytes)基因組的二倍體孤雌胚胎的構建和孤雌胚胎干細胞(NF-pES cells)系的建立在應用常規(guī)生發(fā)泡移植技術構建重構二倍體孤雌胚胎過程中，GV

6、期卵子的卵周隙是影響去核效率的一個重要的限制因素。為了解決這一問題，我們發(fā)明了一套基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術程序。具體做法是在去核操作前將GV期卵子的透明帶去除，將所有卵子都放在濃度為5或25μg/ml CCB的操作液內，僅使用一個顯微操作臂進行去核，去核率為83.76％。去核GV期卵子經PHA-P與未生長卵子進行粘合，在融合電壓為180V、脈沖寬度為20μs和一次電脈沖下融合效率為62.80％。融合的重構卵子在TYH中

7、進行成熟培養(yǎng)，成熟率為70.89％?；凇皕ona-free”的生發(fā)泡移植技術不僅無需依據卵周隙的大小取舍卵子，減少了切口針對卵子的破壞和提高了去核效率，而且降低了操作難度，易于為初學者所掌握。 已有研究證實未生長卵子的基因組表達某些父源性表達的基因而某些母源性表達的基因則被抑制。因此未生長卵子基因組在一定程度上充當了精子基因組的作用。本研究應用基于“zona-free”的生發(fā)泡移植技術，使用383枚GV期卵子共獲得64枚來自

8、未生長卵子的MⅡ期卵子。將這些MⅡ期卵子的核區(qū)移植到體內成熟的昆明小鼠MⅡ期卵子的透明帶下，共重構成功56枚。經電融合處理，有51枚發(fā)生融合。經SrCl<,2>激活后，獲得22枚形成兩個原核和排出兩個極體的重構胚。將這22枚重構胚繼續(xù)體外發(fā)育共得到13枚囊胚。從這13枚囊胚共分離得到3株NF-pES細胞系。所有NF-pES細胞株均表達堿性磷酸酶活性，SSEA-1和Oct-4陽性。選取其中兩株NF-pES細胞系制備嵌合體。嵌合體鼠的心臟、

9、脾、腎和骨髓的流式細胞檢驗結果顯示，一株NF-pES細胞(NF-pES-1)在以上四個臟器的嵌合率分別是15.07％、41.02％、3.55％和11.53％。另外一株NF-pES細胞系(NF-pES-2)是83.36％、68.74％、29.70％和50.44％。對照組受精胚來源的ES細胞在其嵌合鼠的心臟、脾、腎和骨髓的嵌合率分別是77.96％、84.06％、42.49％和52.02％。方差分析顯示NF-pES-2在心臟、脾和骨髓上的嵌合

10、率與受精胚來源的ES細胞無顯著差異。這一結果表明包含有未生長卵子和成熟卵子基因組的孤雌胚胎干細胞至少在心臟、脾和骨髓方向發(fā)育上具有和受精胚來源的胚胎干細胞相當的發(fā)育潛能，這為孤雌胚胎干細胞在再生醫(yī)學領域的應用提供了進一步的證據。 3．肌肉損傷修復模型的建立NF-pES細胞來源的畸胎瘤和嵌合體組織中存在大量骨骼肌纖維的事實表明NF-pES細胞具有分化成為骨骼肌纖維的潛能。臨床上有一些退行性疾病與肌肉損傷或功能喪失有關如杜氏肌營

11、養(yǎng)不良癥等。目前尚無特效藥應用于此類疾病的治療。近年來發(fā)現細胞移植是一個非常有效的辦法。為了證明NF-pES細胞具有作為移植供體細胞治療該類疾病的臨床應用價值，我們使用心臟毒素處理結合射線照射小鼠的脛骨前肌制造了肌肉損傷模型。首先NF-pES細胞在體外誘導分化成為混合的前體細胞，然后將這些前體細胞移植到小鼠脛骨前肌受損部位。一個月后取材進行免疫組化分析。結果顯示NF-pES細胞來源的前體細胞能夠嵌合到骨骼肌組織，并且形成部分骨骼肌纖維。