二倍體馬鈴薯的組培再生體系建立及抗性相關(guān)基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、以二倍體馬鈴薯不同基因型的莖段外植體為材料，建立了離體再生體系和轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系；構(gòu)建StPMEI基因的過(guò)量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化馬鈴薯二倍體感病基因型ED25，StPMEI反義基因表達(dá)載體以及StPMEI、StPI和StRLK基因的RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化二倍體抗病基因型ED13，獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株37棵，其中15棵已經(jīng)進(jìn)行了PCR的初步鑒定。
　　 分別以二倍體馬鈴薯抗病基因型ED13、CE171和感病基因型ED25的莖段為外植體，在優(yōu)化

2、植物激素濃度及配比等的基礎(chǔ)上，對(duì)不同基因型的組培再生進(jìn)行了研究和探討，結(jié)果表明：不同的基因型具有不同的激素及濃度配比要求。固體—液體培養(yǎng)基雙層看護(hù)培養(yǎng)對(duì)于二倍體馬鈴薯莖段愈傷組織的誘導(dǎo)是必要的，尤以固體培養(yǎng)基中NAA和6-BA的濃度配比2∶2為佳。對(duì)于ED13而言，液體培養(yǎng)基中2，4-D和KT的濃度配比2.5∶0.5為佳，相比之下對(duì)于CE171，則以1.5∶1為最好，二者的愈傷誘導(dǎo)率均達(dá)100％；然而對(duì)于基因型ED25，只有在NAA和6

3、-BA的濃度配比2∶1，2，4-D和KT的濃度配比1.5∶1時(shí)才能形成較好的愈傷。ZT在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化過(guò)程中具有重要作用，單獨(dú)使用ZT，濃度為1mg/L時(shí)，ED13和CE171的芽分化率均可達(dá)95％以上；而對(duì)于ED25，則只有在ZT和6-BA配合使用，濃度配比為0.5∶2.5時(shí)才可獲得較高的芽分化率。
　　 以ED13基因組DNA為模板，利用基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得了StPMEI、StPI和StRLK基因的完

4、整編碼區(qū)及相應(yīng)的用于RNAi的基因片段，經(jīng)T-A連接后，轉(zhuǎn)化受體菌獲得了DH5α陽(yáng)性重組子。進(jìn)一步酶切及連接后，成功地構(gòu)建了StPMEI正、反義全長(zhǎng)基因的植物表達(dá)載體pBI-PMEI和pBI-AS-PMEI及RNAi植物表達(dá)載體pCH-PMEI、pCH-PI和pCH-RLK，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404后進(jìn)行馬鈴薯的快速基因轉(zhuǎn)化，獲得了預(yù)期轉(zhuǎn)化子37株，其中15株已經(jīng)進(jìn)行了PCR檢測(cè)確定為陽(yáng)性，其它的22株尚待檢測(cè)確定。
　　 影響

5、莖段外植體轉(zhuǎn)化效率的因素很多。研究表明：預(yù)培養(yǎng)2d，菌液OD600為0.5，侵染時(shí)間10min，共培養(yǎng)時(shí)間2d，可獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。合適的抗生素篩選壓對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株的選擇至關(guān)重要：對(duì)于抗病基因型ED13而言，卡那霉素(Km)和慶大霉素的篩選濃度均以50mg/L為佳，而對(duì)于感病基因型ED25，Km篩選濃度則以30mg/L為佳。在轉(zhuǎn)基因植株的篩選過(guò)程中，農(nóng)桿菌抑菌劑特美汀(Tim)的濃度以150mg/L抑菌效果最好，不但可以完全抑制農(nóng)桿菌