歐美楊組培體系的建立和Trx基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、本研究首先建立了歐美楊組培體系。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究建立了其組織培養(yǎng)和再生系統(tǒng)，通過(guò)此系統(tǒng)可在短期內(nèi)獲得大量擴(kuò)繁植株，得出不同階段最佳培養(yǎng)基與激素含量為：(1)再生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1/2MH+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L；(2)繼代培養(yǎng)基：MH+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L；(3)抽莖培養(yǎng)基：MH+6-BA 0.1 mg/L +NAA 0.05 mg/L；(4)生根培養(yǎng)基：MH+IBA 0.3

2、mg/L。然后將從抗旱、耐鹽植物檉柳(Tamarix androssowii)中克隆得到的硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)基因Trx，成功構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pYES2，并對(duì)其進(jìn)行釀酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證檉柳Trx基因的功能，同時(shí)將其構(gòu)建到載體pROKII上并獲得攜帶Trx的植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Trx基因?qū)霘W美楊基因組中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因歐美楊的干旱脅迫試驗(yàn)，對(duì)硫氧還蛋白進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。 將Trx基因與酵母

3、表達(dá)載體pYES2連接，獲得了pYES2-Trx重組質(zhì)粒。將pYES2-Trx轉(zhuǎn)化酵母菌INVScI。隨機(jī)挑選2個(gè)INVScI(pYES2-Trx)單菌落，經(jīng)PCR擴(kuò)增證明Trx基因已構(gòu)建到pYES2載體上。對(duì)1NVScl(pYES2-Trx)和INVScI(pYES2)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，研究外源基因Trx在酵母中的的表達(dá)情況。重組酵母INVScl(pYES2-Trx)的 NaCl、Na<,2>CO<,3>、NaHCO<,3>、干旱、紫外線

4、等脅迫實(shí)驗(yàn)證明，INVScI(pYES2-Trx)酵母的抗逆性明顯高于對(duì)照INVScI(pYES2)菌株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在酵母受到逆境脅迫時(shí)，Trx基因表達(dá)的硫氧還蛋白對(duì)酵母細(xì)胞起到了保護(hù)作用，同時(shí)也證實(shí)了來(lái)源于檉柳的Trx基因具有提高真核生物抗逆性的功能。 通過(guò)對(duì)歐美楊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，共獲33株卡那霉素抗性芽，從中選出長(zhǎng)勢(shì)最優(yōu)的10個(gè)株系，進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性，初步證明Trx基因已整合到歐美楊基因組中；對(duì)10個(gè)株系進(jìn)行No

5、rthern雜交，其中7個(gè)株系出現(xiàn)雜交譜帶，證明Trx轉(zhuǎn)基因能夠在這7株系中轉(zhuǎn)錄。 分別對(duì)7個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了干旱脅迫試驗(yàn)，分析逆境脅迫條件下轉(zhuǎn)基因歐美楊與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諝W美楊株系間丙二醛(MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶(SOD)活性、葉綠素含量、相對(duì)生長(zhǎng)量等指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，干旱脅迫處理8d時(shí)，轉(zhuǎn)基因歐美楊相對(duì)電導(dǎo)率平均值低于對(duì)照歐美楊的9.17％；對(duì)照歐美楊MDA含量為30.015μmol·g<'-1>，而轉(zhuǎn)基因

6、歐美楊MDA含量大多在26 μmol·g<'-1>左右，低于對(duì)照歐美楊；此時(shí)轉(zhuǎn)基因歐美楊的葉綠素平均含量為28.090 mg.g<'-1>，高于對(duì)照的23.233％，而SOD平均活性高于對(duì)照的90.0％；對(duì)干旱脅迫8d時(shí)轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)生長(zhǎng)量進(jìn)行調(diào)查，各轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)塵長(zhǎng)量大于對(duì)照株系的相對(duì)生長(zhǎng)量，說(shuō)明硫氧還蛋白基因的導(dǎo)入提高了歐美楊的抗旱能力。 綜合以上結(jié)果，硫氧還蛋白基因的組成型表達(dá)能夠不同程度提高轉(zhuǎn)基因歐美楊干旱脅迫下細(xì)胞膜