山梨葉片再生體系的建立和遺傳轉化.pdf

1、本試驗通過山梨種子和莖段的組織培養(yǎng)，獲得了無菌苗葉片。然后以無菌苗葉片為外植體初步建立了山梨葉片的再生體系。并且嘗試將基因rolB轉入山梨的葉片中。本研究的結果如下： 1、以山梨的種子為材料進行培養(yǎng)表明：種子消毒時間以5分鐘為宜，污染少，萌發(fā)率高。3天左右種子即可萌發(fā)，10天就可以長出小苗。繼代30天葉片就可作為外植體使用。不添加激素的MS和V1培養(yǎng)基都可作為山梨種子萌發(fā)的培養(yǎng)基。 2、以莖段為外植體進行培養(yǎng)表明：從果園

2、采來的三年生梨樹新梢莖段適宜的接種時間為4月份，且用0.1％的升汞消毒以7分鐘為宜，腋芽萌發(fā)率高，為90％。外植體單芽莖段接種在芽啟動培養(yǎng)基MS+1.0～2.5mg/LBA+0.4mg/LIBA上時，10天后葉腋處長出新芽，20天后苗高平均為2.4cm，幼芽長勢良好，30天后可繼代增殖培養(yǎng)。新芽轉接在芽誘導培養(yǎng)基MS+2.0mg/LBA+0.2mg/L上，小苗生長良好，葉片正常，并在基部有增殖芽的出現(xiàn)，增殖系數(shù)為3.6。 3、以

3、葉片為外植體培養(yǎng)表明：取繼代培養(yǎng)30天左右的無菌苗葉片為材料，接種在MS+5.0mg/LBA+0.4gm/LIBA培養(yǎng)基上，20～30天后產生不定芽，再生頻率48.6％，再生芽數(shù)3.83；暗培養(yǎng)20天，葉片再生頻率最高；遠軸面向下的葉片再生頻率和再生芽數(shù)高于近軸面向上的再生頻率和再生芽數(shù)；葉片基部的再生頻率顯著高于葉片中部和尖部，再生頻率為68.1％。 4、山梨試管苗生根實驗表明：1/2MS(大量元素)為最佳生根培養(yǎng)基，優(yōu)于1/

4、3MS和1/4MS；生長素IBA優(yōu)于NAA，而以兩者配合使用效果更好；培養(yǎng)基中添加2％的蔗糖優(yōu)于3％的蔗糖。最佳生根誘導培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/LIBA+0.5mg/LNAA+2％蔗糖。暗培養(yǎng)3天，生根率可達71.9％ 5、采用農桿菌介導的轉化方法將rolB基因轉入到山梨的葉片中。在轉化之前進行了葉片外植體對卡那霉素的敏感性試驗，篩選出卡那霉素的篩選壓為50～75mg/L。但因為種種原因，并沒有獲得轉基因植株。