野薔薇再生體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、野薔薇(Rosa multiflora Thunb.)又名多花薔薇，是薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)落葉木本植物，具有較高的觀賞價值和一定的藥用價值。野薔薇具有繁殖容易、生長快、抗熱性強(qiáng)及觀賞價值高的特點(diǎn)，既可用作月季砧木，也可用作育種的親本。但野薔薇有些性狀，如花期短、皮刺多等，不適合用作砧木和親本，需要利用植物基因工程進(jìn)行改良。本實(shí)驗(yàn)對華中地區(qū)四種野薔薇的再生和遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了系統(tǒng)研究。主要的研究結(jié)果如下：
　　

2、 1.建立了野薔薇葉片不定芽直接再生體系
　　 以四種野薔薇葉片為外植體，研究了基因型、植物生長調(diào)節(jié)劑、不同的外植體來源對其直接再生的影響，以篩選出不定芽誘導(dǎo)率最高的株系及最優(yōu)的誘導(dǎo)條件。研究結(jié)果表明：四種野薔薇的不定芽在1/2MS+0.05mg/L NAA+1.5mg/LTDZ+10mg/L AgNO3+3% Glucose+0.3% GEL的培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率差異顯著，野薔薇2號為78.20%，3號為61.16%，4號為13.

3、00%，1號僅5.93%；野薔薇2號的田間葉片外植體的不定芽誘導(dǎo)率高于組培苗葉片；基因型、植物生長調(diào)節(jié)劑及葉片的狀態(tài)對野薔薇的直接再生影響顯著。
　　 2.建立了野薔薇體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生體系
　　 以四種野薔薇的葉片為外植體，研究了基因型、添加劑、植物生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)條件對體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響。另外，以野薔薇2號和野薔薇4號的體細(xì)胞胚為外植體，研究了植物生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)條件對體細(xì)胞胚增殖、萌發(fā)的影響。以葉片為外植體進(jìn)行體

4、細(xì)胞胚誘導(dǎo)時，4種不同基因型野薔薇的葉片均有體細(xì)胞胚發(fā)生。野薔薇1號和野薔薇4號在MS+5.0mg/L2，4-D+400mg/L L-p+10mg/L AgNO3+3%Glucose+0.3% GEL的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高分別為4.38%、5.01%；野薔薇2號和野薔薇3號在MS+4.0mg/L2，4-D+400mg/L，L-p+10mg/L AgNO3+3% Glucose+0.3% GEL的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高分別為4.63%、2.78

5、%。野薔薇2號體細(xì)胞胚在MS+1.0mg/L
　　 2，4-D+0.01mg/L BA+3% Glucose+0.3% GEL的培養(yǎng)基上增殖效果最好，增殖系數(shù)為4.15。野薔薇4號在MS+0.5mg/L2，4-D+0.005mg/L BA+3% Glucose+0.3% GEL的培養(yǎng)基上增殖效果最好，增殖系數(shù)為3.55。野薔薇2號體細(xì)胞胚在MS+0.5mg/L BA+1.0mg/L TDZ+3% Glucose+0.3% GEL

6、的萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高為91.67%，野薔薇4號MS+0.5mg/L BA+1.0mg/L TDZ+3% Glucose+0.3% GEL的萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高為83.33%。
　　 3.初步建立了野薔薇的遺傳轉(zhuǎn)化體系
　　 以體細(xì)胞胚為外植體，研究了卡那霉素和潮霉素兩種抗生素對野薔薇2號體細(xì)胞胚增殖的影響。結(jié)果表明，在含120mg/LKm的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，60.18%的體細(xì)胞胚褐化死亡；在含80mg/LHyg的

7、培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，93.30%的體細(xì)胞胚褐化死亡。以體細(xì)胞胚為外植體，研究了潮霉素對野薔薇4號體細(xì)胞胚增殖的影響，在含70 mg/L Hyg的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月，66.76%的體細(xì)胞胚褐化死亡。
　　 分別以野薔薇2號、4號體細(xì)胞胚作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的受體，設(shè)定不同的侵染時間和共培養(yǎng)時間，統(tǒng)計(jì)并分析共培養(yǎng)后GUS基因瞬間表達(dá)率的結(jié)果表明：野薔薇2號體細(xì)胞胚侵染40min，共培養(yǎng)3d，GUS瞬間表達(dá)率最高達(dá)到65.30%；野

8、薔薇2號體細(xì)胞胚侵染40min，共培養(yǎng)3d，在MS+1.0mg/L2，4-D+300mg/L Cef+50mg/L Hyg+3% Glucose+0.3% GEL的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個月后，GUS穩(wěn)定表達(dá)的體細(xì)胞胚約占6.52%。野薔薇4號體細(xì)胞胚侵染40min，共培養(yǎng)5d，GUS瞬間表達(dá)率最高達(dá)到69.51%；野薔薇4號體細(xì)胞胚侵染40min，共培養(yǎng)5d：在MS+1.0mg/L2，4-D+300mg/L Cef+50mg/L Hyg+