光葉薔薇再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步研究.pdf

1、庭院月季品種‘光葉薔薇’(Rosa wichuriana ‘Basye's thornless’)是通過光葉薔薇培育的園藝雜交品種，它具有的一年一次開花習(xí)性、花白色、五瓣花、莖匍匐等性狀是目前月季育種主要目標(biāo)性狀如連續(xù)開花、花色豐富、重瓣和莖直立等的相對性狀，其再生體系及轉(zhuǎn)化體系的建立將為月季的花色、花期、花的瓣性等性狀相關(guān)基因的功能驗證奠定基礎(chǔ)，對這些性狀的遺傳規(guī)律研究和分子育種具有重要的意義。
　　本試驗以‘光葉薔薇’為材料，

2、建立了組培快繁體系，系統(tǒng)開展了器官直接發(fā)生途徑和器官間接發(fā)生途徑研究及遺傳轉(zhuǎn)化的初步研究。此外，本研究還對‘光葉薔薇’體細(xì)胞胚發(fā)生途徑進(jìn)行了初步嘗試，并對其愈傷組織發(fā)育過程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)觀察。主要的研究結(jié)果如下:
　　1.‘光葉薔薇’組培快繁體系的建立
　　以‘光葉薔薇’帶腋芽的莖段為外植體，建立快繁體系。對影響‘光葉薔薇’繼代增殖和無菌苗生根的條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:適合‘光葉薔薇’增殖的培養(yǎng)基是:MS+0.1mg/L 6

3、-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂(pH5.8-6.0);適合‘光葉薔薇’無菌苗的生根培養(yǎng)基是:1/2MS+0.05mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L瓊脂(pH5.8-6.0)，生根率為100％。
　　2.‘光葉薔薇’的葉片直接再生體系的建立
　　以‘光葉薔薇’的頂生幼嫩葉片為外植體，探討了葉片幼嫩程度、暗培養(yǎng)時間和植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導(dǎo)的影響。研究結(jié)果表明:‘光葉薔薇’小

4、葉的幼嫩程度不同，不定芽的誘導(dǎo)率有顯著的差異，頂生幼嫩小葉的誘導(dǎo)率最高，為16.80％;不同的暗培養(yǎng)時間下不定芽的誘導(dǎo)率存在顯著的差異，暗培養(yǎng)時間為12d時不定芽的誘導(dǎo)率最高，為16.00％;在誘導(dǎo)培養(yǎng)基11/2MS+1.5mg/L TDZ+0.05mg/L NAA+100mg/L CH+10mg/L AgNO3+30g/L葡萄糖+6.5g/L瓊脂(pH5.8-6.0)上暗培養(yǎng)12d后轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基MS+0.5mg/L6-BA+0.0

5、5mg/L NAA+1.0mg/L GA3+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝膠(pH5.8-6.0)上光下培養(yǎng)25d后，不定芽的誘導(dǎo)率最高，為10.38％。
　　3.‘光葉薔薇’器官間接再生體系的建立
　　以‘光葉薔薇’的頂生幼嫩小葉為外植體，篩選愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基，并對影響愈傷組織分化的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基添加物等因素進(jìn)行了探討。研究結(jié)果表明:‘光葉薔薇’小葉外植體最適的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:M

6、S+7.0mg/L NAA+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝膠(pH5.8-6.0)，愈傷組織誘導(dǎo)率為87.50％，愈傷組織松軟、乳白色、顆粒狀;繼代增殖的愈傷組織轉(zhuǎn)接在分化培養(yǎng)基MS+5.0mg/L TDZ+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝膠(pH5.8-6.0)上暗培10d后光下培養(yǎng)25d，不定芽分化率最高，為18.34％。
　　4.‘光葉薔薇’體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的初步研究
　　以‘光葉薔薇’的頂生幼嫩小葉為外植體

7、，通過直接途徑和間接途徑對體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:通過直接發(fā)生途徑和間接發(fā)生途徑均未得到‘光葉薔薇’的體細(xì)胞胚。間接發(fā)生途徑在培養(yǎng)基MS+1.0mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝膠(pH5.8-6.0)或MS+5.0mg/L TDZ+0.5mg/L NAA+1.0mg/L GA3+30g/L葡萄糖+2.5g/L植物凝膠(pH5.8-6.0)上可以得到‘光葉薔薇’假珠芽，并得到再

8、生植株。
　　5.愈傷組織細(xì)胞學(xué)觀察
　　選取愈傷組織誘導(dǎo)至分化各階段材料進(jìn)行石蠟切片顯微觀察，增殖的胚性愈傷進(jìn)行超薄切片超顯微觀察。結(jié)果表明:外觀色澤鮮亮、基本為淺黃色或淺綠色、培養(yǎng)過程中不易褐化的愈傷組織，其細(xì)胞排列緊密，多數(shù)為圓形或近圓形，細(xì)胞壁很薄，通常有很大的細(xì)胞核，占整個細(xì)胞體積的比例較大，細(xì)胞質(zhì)濃厚。這類愈傷組織多具有胚性，易于分化。
　　6.初步建立了‘光葉薔薇’GUS基因轉(zhuǎn)化體系
　　根據(jù)本研究

9、建立的‘光葉薔薇’的兩種再生體系，以其小葉和愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體進(jìn)行GUS報告基因的遺傳轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌侵染的小葉和愈傷組織經(jīng)GUS染液染色，計算GUS基因瞬時表達(dá)率，以此判定各因素對‘光葉薔薇’遺傳轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明:對‘光葉薔薇’遺傳轉(zhuǎn)化影響最大的是外植體的類型，愈傷組織GUS基因瞬時表達(dá)顯示為陽性，小葉外植體在不同的條件下對農(nóng)桿菌的侵染均不敏感，GUS基因瞬時表達(dá)顯示為陰性;除外植體類型外，影響‘光葉薔薇’遺傳轉(zhuǎn)化的重要因素還有菌液