小麥再生體系的建立及遺傳轉化的研究.pdf

1、小麥是重要的糧食作物，利用植物基因工程技術進行小麥遺傳改良是小麥遺傳育種的新方向。本文以豫麥34、矮抗58、百麥4411、百麥0566、百農64、百麥1號、抗凍早-30、06-4046八個小麥品種(系)的成熟胚為起始外植體，通過胚性愈傷組織誘導及分化，建立其植株再生體系。在此基礎上，探討了農桿菌介導法進行成熟胚愈傷組織遺傳轉化的可行性。另外，本研究還對花粉管通道法和農桿菌菌液滴沾小花法對小麥整株轉基因技術進行了初步研究。 本研究

2、主要研究結果如下： 1、從上述八個小麥品種中篩選出了愈傷組織誘導率高、分化再生能力較強、成苗率較高的三個基因型(即豫麥34、矮抗58及百麥1號)，建立了高效穩(wěn)定的植株再生體系。以下因素對小麥再生有較大影響。 ①光照：在全黑暗培養(yǎng)條件下胚狀體誘導率要明顯高于光照培養(yǎng)。 ②溫度：在26℃條件下對胚狀體誘導和分化再生苗均表現(xiàn)較好，且此溫度下愈傷組織大多為淡黃色，質地較硬，生長狀態(tài)好。 ③繼代時間：頻繁繼代可保持

3、較高的胚狀體誘導率，一般5～7天繼代一次對于防止褐化有較好效果。 ④有機物：在誘導和分化培養(yǎng)基中均添加40.mg·L-1的CH(水解酪蛋白)可促進胚狀體的發(fā)生及分化。 ⑤激素：誘導培養(yǎng)基中附加2，4-D2 mg·L-1時有利于胚狀體發(fā)生；與NAA(α-萘乙酸)和6-BA(6-芐基腺嘌呤)的效果相比，分化培養(yǎng)基中附加KT(細胞激動素)時更有利于胚狀體分化及植株再生，但三個基因型所需KT的濃度不同，豫麥34和矮抗58在含KT

4、2.0 mg·L-1的培養(yǎng)基中分化再生能力更強，百麥1號則在含KT0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基中分化再生能力更強。 2、對成熟胚誘導的愈傷組織進行組織細胞學觀察，結果顯示：愈傷組織中既含有胚性愈傷，又含有非胚性愈傷，兩者在細胞結構上存在差異：胚性愈傷組織細胞核較大，染色較深，細胞質較多，細胞較小，多為圓型，排列整齊，細胞間隙較?。环桥咝杂鷤M織細胞核較小，細胞個體較大，液泡較大，多為長型排列雜亂。 3、以豫麥34、矮抗5

5、8、百麥1號的成熟胚愈傷組織為受體材料，利用農桿菌介導法將重組質粒pCAMBIA1300-IPT(含有潮霉素(Hyg)篩選基因和GUS報告基因)上攜帶的外源目的基因IPT導入上述受體中。對影響其轉化率的主要因素進行了優(yōu)化，①抗生素選擇壓：豫麥34和百麥1號其潮霉素選擇壓為50 mg·L-1；矮抗58其潮霉素選擇壓為70 mg·L-1。②菌液濃度和浸染時間：菌液濃度的梯度試驗表明OD600=0.6，侵染30min時是外植體轉化比較有利的組

6、合條件。③預培養(yǎng)：預培養(yǎng)3天可以較好的提高轉化效率，轉化率可達6.97％。④乙酰丁香酮(AS)：在活化農桿菌菌株、共培養(yǎng)基、重懸液(MS)中均加入AS20.μmol·L-1可以較好的提高轉化率。 4、利用花粉管通道法將重組質粒pCAMBIA1300-IPT上攜帶的IPT基因導入矮抗58、抗凍早-30、百麥4411、06-4046和百麥1號5個小麥品種(系)。花粉管通道法共處理小花1217朵，收獲T0代種子956粒，結實率為78.