猬實(shí)再生體系的建立及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本論文以瀕危植物猬實(shí)（Kolkwitzia amabilis Graebn.）為研究對象。主要研究內(nèi)容為種子休眠的破除，再生體系的建立和遺傳轉(zhuǎn)化的研究。
　　主要研究結(jié)果如下：
　?。?）催芽試驗(yàn)選取當(dāng)年采集的種子為實(shí)驗(yàn)材料，通過不同溫度熱水浸種、不同時間濃硫酸處理、不同濃度赤霉素處理及變溫處理后，在培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)對比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，80℃熱水處理后溫水浸種48 h或用98％的濃硫酸處理20 min，最后用100 mg/L

2、的赤霉素處理24 h能有效提高猬實(shí)種子萌發(fā)的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，是高效的催芽手段。變溫周期6 h，處理15個循環(huán)，能較好替代赤霉素處理的作用。
　　（2）用栽培猬實(shí)的種子無菌發(fā)芽獲得試管苗，然后用試管苗的葉片進(jìn)行離體培養(yǎng)，用二步法建立猬實(shí)的再生體系。為遺傳轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備。試驗(yàn)結(jié)果表明：猬實(shí)葉片誘導(dǎo)愈傷的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.3 mg/L+NAA2.0 mg/L；分步培養(yǎng)能使愈傷組織獲得高效芽分化，先在高細(xì)胞分裂素濃度的芽分化培養(yǎng)基

3、上（MS+6-BA4.0 mg/L+TDZ0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L）培養(yǎng)一周，之后于不添加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行一周的4℃低溫培養(yǎng)，扣除生長激素，最后轉(zhuǎn)接到低細(xì)胞分裂素的芽分化培養(yǎng)基上（MS+6-BA1.0 mg/L+TDZ0.5 mg/L+IBA0.1 mg/L）；最適宜的生根培養(yǎng)基是MS+NAA0.2 mg/L。
　?。?）猬實(shí)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立有助于單種屬植物猬實(shí)的深入研究，發(fā)展其試驗(yàn)潛力。通過離體培養(yǎng)獲得無

4、菌植株，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化猬實(shí)外植體，導(dǎo)入GUS（β-葡萄糖苷酸酶基因）。試驗(yàn)結(jié)果表明以葉片愈傷組織為受體，預(yù)培養(yǎng)4 d，以濃度為OD600=0.6的菌液侵染40 min，并附加乙酰丁香酮100μmol/L共培養(yǎng)3 d，能獲得較理想的轉(zhuǎn)化效果。50 mg/L的卡那霉素和400 mg/L頭孢霉素能得到很好的篩選效果。對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS化學(xué)組織染色，證明GUS基因已整合到猬實(shí)基因組中。
　　試驗(yàn)為今后猬實(shí)穩(wěn)定再生體系、遺傳轉(zhuǎn)化體