大青楊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其LbDREB基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、大青楊是我國東北林區(qū)特有的鄉(xiāng)土樹種,生長快、材質(zhì)優(yōu)良,是造紙及膠合板材極好的原料。但由于目前東北林區(qū)無或極少皆伐跡地,多為土壤干旱瘠薄、地力衰退嚴(yán)重的退耕還林地,急需大量耐旱、抗寒、速生、優(yōu)質(zhì)的大青楊新品系。本研究以大青楊為材料,進行外植體選擇、基本培養(yǎng)基選擇、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基配方篩選,建立大青楊遺傳轉(zhuǎn)化體系；采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將抗旱基因二色補血草LbDREB轉(zhuǎn)入大青楊中,并進行分子檢測及耐旱、耐寒能力測試研究,主要實驗結(jié)果如

2、下:
　　 1、建立大青楊的遺傳轉(zhuǎn)化體系:外植體取材部位為苗高為50 cm左右苗木的第二莖節(jié),分化培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg l-16-BA+0.1 mg l-1NAA,生根培養(yǎng)基為1/2MS；轉(zhuǎn)基因大青楊受體材料為大青楊形態(tài)學(xué)上端的第三片葉子和形態(tài)學(xué)上端三個莖節(jié)。
　　 2、通過卡納霉素濃度梯度試驗確立葉片分化對卡那霉素的臨界濃度為50 mg l-1；以大青楊組培苗葉片為受體材料,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入LbDREB

3、基因,轉(zhuǎn)化率為2.67％；對獲得的40抗性愈傷進行了PCR擴增檢測,其中17株有特異性擴增條帶產(chǎn)生,而陰性對照沒有任何擴增條帶,初步證明了LbDREB基因己被導(dǎo)入到大青楊基因組中；將17株P(guān)CR陽性植株進行RT-PCR檢測,結(jié)果顯示有6株顯陽性,說明這6株在轉(zhuǎn)錄水平上表達；形態(tài)學(xué)觀察表明,RT-PCR檢測陽性的植株都有矮化現(xiàn)象,其他植株的沒有矮化現(xiàn)象。
　　 3、用轉(zhuǎn)基因葉片,莖節(jié)、根在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)進行擴繁試驗,發(fā)現(xiàn)根系較轉(zhuǎn)

4、基因植株的其他器官分化能力強；不同長度的根分化能力也不同,3-5cm、6—8cm、1-3cm的主根系分化能力較強,增殖系數(shù)分別達到15.87、11.6、9.67；子代不定芽,進行PCR檢測,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株必須通過多次分化篩選之后才可以以微繁的方式增殖；但是莖段中腋芽發(fā)育出來的子代,能夠保持其基因型不變,增殖系數(shù)較低,2.9～3.5之間；石蠟切片表明多細(xì)胞共同發(fā)育成芽,最先得到的芽為嵌合體。
　　 4、通過-20℃脅迫、NaCl、

5、NaHCO3、甘露醇脅迫實驗的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn):大青楊轉(zhuǎn)LbDREB基因植株抗凍性、耐鹽、耐堿均強于對照植株。
　　 5、不給水脅迫、15％PEG脅迫、甘露醇脅迫下研究葉綠素及熒光參數(shù)測定發(fā)現(xiàn):矮化植株E3號轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量低于野生型和不矮化A1號轉(zhuǎn)基因植株。熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、qP、ETR也低于野生型和不矮化A1號轉(zhuǎn)基因植株。但是NPQ、qN高于野生型。所以在脅迫狀態(tài)下E3號轉(zhuǎn)基因植株抗光氧化能力高于野生型和A1號