菊花再生體系的建立及GhEREB2基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、菊花(Chrysanthemllm morifolium Ramat.)屬菊科菊屬，多年生草本植物，品種繁多。茶菊(Chrysanthemllm morifolium cv.‘Chaju’)是菊花中一種重要的藥用品種，是河南道地藥材懷菊花的主栽品種之一。懷菊花栽培歷史悠久，由于長(zhǎng)期采用無(wú)性繁殖，致使品種退化，對(duì)病害、干旱等因素的抗性減弱，培育對(duì)不良環(huán)境條件以及病蟲(chóng)害具有較強(qiáng)抵抗力的品種是目前亟待解決的問(wèn)題。GhEREB2基因是從棉花體內(nèi)

2、提取的一種轉(zhuǎn)錄因子基因，它能夠調(diào)控PR基因(PR，pathogensis related)(病原相關(guān)蛋白基因，如幾丁質(zhì)酶基因、β-1，3-葡聚糖酶基因等)和其它相關(guān)防御基因的表達(dá)，使植物對(duì)多種真菌病害和非生物脅迫表現(xiàn)抗性。 本實(shí)驗(yàn)以菊花品種茶菊為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)茶菊的再生條件和轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)GhEREB2基因?qū)Σ杈者M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，旨在建立茶菊高效的再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，并獲得具有對(duì)真菌病害及非生物脅迫具有

3、廣譜抗性的懷菊品種。主要內(nèi)容如下： (1)利用茶菊的葉盤(pán)、莖段為外植體，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA和NAA，研究不同激素濃度配比對(duì)菊花直接再生不定芽和不定芽生根的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)葉盤(pán)、莖段直接再生不定芽的最適分化培養(yǎng)基分別是MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L和MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L；不定芽在MS、MS+NAA0.1-0.2 mg/L、1/2 MS+NAA0.1-0

4、.2 mg/L的生根培養(yǎng)基上生根率均可達(dá)到100％；生根苗移栽成活率100％。優(yōu)化了茶菊再生條件，建立了茶菊葉盤(pán)和莖段的高效再生體系。 (2)以葉盤(pán)為外植體，研究葉盤(pán)對(duì)潮霉素、頭孢霉素的敏感性，確定轉(zhuǎn)化過(guò)程中合適的抗生素篩選壓和抑菌濃度。結(jié)果表明，6 mg/L潮霉素可抑制葉盤(pán)的分化，3 mg/L潮霉素即可抑制小苗的生根。20.mg/L的頭孢唑啉鈉對(duì)外植體分化再生影響很小，并可有效抑制農(nóng)桿菌再生，可以作為轉(zhuǎn)化過(guò)程中的抑菌濃度。

5、 (3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)GhEREB2基因?qū)θ~盤(pán)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，研究轉(zhuǎn)化過(guò)程中預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、AS的添加方式、共培養(yǎng)時(shí)間、延遲篩選時(shí)間四個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果顯示，侵染時(shí)間采用8-10分鐘條件下，葉盤(pán)經(jīng)預(yù)培養(yǎng)1天，共培養(yǎng)2-3天，在侵染液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加10.μmol/L的乙酰丁香酮，延遲培養(yǎng)4天，轉(zhuǎn)化效率較高。葉盤(pán)經(jīng)篩選培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.3 mg/L+Cef20.mg/L+Hyg6 mg/L篩選培養(yǎng)，最后