百合高頻再生體系建立及GO基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、試驗以東方百合雜種系品種西伯利亞和索蚌為試材，通過鱗片培養(yǎng)的無菌苗，研究了百合葉片離體再生不定芽的主要影響因素，建立了高頻穩(wěn)定的百合葉片再生體系。試驗研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百合遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素，建立了有效的轉(zhuǎn)化體系，獲得了西伯利亞百合轉(zhuǎn)葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，GO)基因的轉(zhuǎn)化植株。具體結(jié)果如下： 百合鱗片培養(yǎng)過程中，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA1mg/L+NAA0.5mg/L+GA30.05mg/L，誘導(dǎo)率達

2、70.4％。東方百合鱗片培養(yǎng)時選用外層或者中層鱗片為宜，誘導(dǎo)率達77.1％，鱗片下部誘導(dǎo)效果優(yōu)于中部和上部，西伯利亞和索蚌的誘導(dǎo)率分別為69.1％和59.5％。鱗片近軸面向上培養(yǎng)效果較好，誘導(dǎo)率為77.8％。 在離體葉片再生體系研究中，分析了外源激素、碳源、外植體、AgNO3等因素對誘導(dǎo)不定芽的影響。結(jié)果表明，激素構(gòu)成和濃度對不定芽再生率有明顯影響。西伯利亞百合葉片最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA2mg/L+ZT1mg/L，再生率達1

3、00.0％，平均單葉再生不定芽數(shù)為1.06，芽質(zhì)量較好。誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加5-7.5mg/LAgNO3能夠促進再生不定芽，添加AgNO3后植株生長健壯、葉片寬厚，基部結(jié)鱗莖，并生成大量不定根。暗培養(yǎng)能促進不定芽的再生，但長時間暗培養(yǎng)會導(dǎo)致幼苗細弱，暗培養(yǎng)時間以7-14天為宜。碳源對誘導(dǎo)不定芽影響不明顯，葡萄糖比麥芽糖和蔗糖誘導(dǎo)率稍高，但無顯著差異。百合試管苗培養(yǎng)最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA0.75mg/L，生根率達98.5％，西伯利亞百合平

4、均單株生根數(shù)為4.13條，索蚌3.96條，根系粗壯、根毛豐富。 試驗研究了影響百合轉(zhuǎn)化的因素，初步建立了百合的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并將GO基因成功轉(zhuǎn)入百合。百合葉片對抗生素G418和卡那霉素反應(yīng)較敏感，培養(yǎng)基中添加G418幼芽生長遲緩、生長狀態(tài)不良，不宜用做抗性芽篩選的鑒定指標；添加卡那霉素對幼芽生長影響較小，可用作百合抗性芽的篩選，當卡那霉素濃度達120mg/L時葉片再生率為5％，可作為篩選的適宜濃度指標。百合對羧芐青霉素適應(yīng)性較強

5、，羧芐青霉素濃度為300-400mg/L時可抑制農(nóng)桿菌生長，但對百合不定芽分化無明顯影響，可以作百合轉(zhuǎn)化抑菌抗生素的濃度指標。 試驗研究了農(nóng)桿菌侵染百合的適宜轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，取苗齡40天的試管苗新展開葉片，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2d，用攜帶目的基因的農(nóng)桿菌LBA4404侵染15-30min(農(nóng)桿菌的濃度約為OD=0.8)。侵染后共培養(yǎng)3-7天，培養(yǎng)基為MS+AS200mg/L+BA2mg/L+ZT1mg/L(MS培養(yǎng)基

6、除去大量元素NH4NO3)，直到肉眼可見淡淡的白色菌斑時，將外植體移入選擇培養(yǎng)基中篩選抗性芽。選擇培養(yǎng)兩周繼代一次，70天后可得抗性植株。百合對農(nóng)桿菌敏感性較差，轉(zhuǎn)化率偏低但脫菌處理較容易。 經(jīng)反復(fù)篩選，獲得了7株抗性植株。試驗采用CTAB法提取百合總DNA，以GO基因內(nèi)部序列設(shè)計引物進行PCR擴增，7株抗性植株中有3株呈陽性。試驗對PCR陽性植株進行了Southern印記雜交，有1株呈陽性，表明目的基因已整合到百合基因組中。試