百合LlACO1基因克隆與遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立.pdf

1、百合（Lilium）是世界上的五大鮮切花之一，深受人們的喜愛。 但是，百合與其它鮮切花一樣隨著花朵的開放而迅速衰老，如何延長百合花朵的保鮮期已成為近二三十年來百合研究的熱點。據(jù)研究報道，百合花的衰老與乙烯的產(chǎn)生有關(guān)，而ACC 氧化酶是乙烯生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，克隆百合ACC 氧化酶基因（ACO）并進行調(diào)控研究和探索，利用基因工程技術(shù)改良百合保鮮期具有重要意義。 本研究以麝香百合為材料，克隆了百合ACO基因并對基因進

2、行了表達分析，進而在ACO 反義載體構(gòu)建、百合遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立及農(nóng)桿菌介導外源基因轉(zhuǎn)化等方面開展一系列工作，取得了以下結(jié)果： 1. 首次從麝香百合中克隆到了ACC 氧化酶基因LlACO1的cDNA全長序列（Genbank No. EU249333）。LlACO1 cDNA 全長為1，067 bp，帶一短poly(A)尾巴，包含26 bp的5’非翻譯區(qū)（UTR）和91 bp的3’ 非翻譯區(qū)，以及954 bp 長的開放讀

3、碼框(ORF)，推導其編碼一個含317氨基酸殘基、分子量為36.18 kDa、等電點(pI)為5.26的蛋白質(zhì)。 對LlACO1 氨基酸序列進行生物信息學分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示，LlACO1 與郁金香的同源性最高（86％），其蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)比較保守，不同物種間的差異不大；具有與oxgenase家族的功能域同源的結(jié)構(gòu)域，在進化關(guān)系上與郁金香、蘭花等比較近。組織特異表達分析結(jié)果表明LlACO1 在百合不同器官中的表達有差異

4、。 2. 首次從麝香百合基因組中克隆得到了LlACO1 全長序列。該基因含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。內(nèi)含子分別位于nt132-312、nt618-969、nt 1342-1671、大小分別為181bp，79bp，330bp。Southern雜交分析結(jié)果表明LlACO1 在百合基因組中呈低拷貝分布。 3. 建立了百合遺傳轉(zhuǎn)化愈傷組織受體系統(tǒng)。以麝香百合幼嫩花部組織為材料，研究篩選出了花絲做為最佳的誘導愈傷組織的外植體，并篩

5、選出了最佳的誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，確立了卡那霉素和潮霉素對百合愈傷組織的最佳篩選濃度，為百合的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎。 4. 構(gòu)建了LlACO1的反義表達載體。利用酶切和連接技術(shù)把LlACO1的反義片段antiLlACO1 連接到pCAMBIA1304 上，并保留了gus報告基因。將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105菌種中，獲得了用于百合轉(zhuǎn)化的含antiLlACO1的工程菌。 5.利用農(nóng)桿菌介導法對麝