百合高頻再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導基因的轉(zhuǎn)入.pdf

1、百合是多年生球根花卉，屬于單子葉植物，具有較高的經(jīng)濟價值和觀賞價值，現(xiàn)已成為世界上最重要的鮮切花之一。植物分子生物學的迅速發(fā)展，為改良植物品質(zhì)和性狀提供了全新的途徑，利用轉(zhuǎn)基因的手段改良百合性狀和品質(zhì)變得切實可行。農(nóng)桿菌作為遺傳轉(zhuǎn)化載體成本低廉、轉(zhuǎn)化率較高，是應用最廣泛的外源基因?qū)敕?。但是百合是單子葉植物，對農(nóng)桿菌具有不敏感性，所以要探索有效途徑提高農(nóng)桿菌介導百合轉(zhuǎn)化率。本實驗以麝香百合的愈傷組織為轉(zhuǎn)化材料，以pBI121(無外源基因

2、)為轉(zhuǎn)化載體，研究農(nóng)桿菌介導的麝香百合轉(zhuǎn)化方法，為麝香百合的遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎。 1．建立高頻再生體系百合再生植株小鱗片和百合花絲均能誘導出大量愈傷組織，且愈傷組織分化率都比較高，所以將二者進行比較，選擇最佳受體材料。小鱗片在激素濃度為6-BA 0.5mg/L，NAA0.1mg/L時再生小植株小鱗片的愈傷形成率最高，達到90％；而花絲在激素濃度為6-BA1.0mg/L，NAA 0.5mg/L愈傷形成率最高，達到86.3％，所以，再

3、生苗小鱗片的愈傷形成能力要比花絲強。小鱗片在激素濃度為6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.05 mg/L時愈傷組織分化率最高，達到93.8％；而花絲在激素濃度為6-BA1.0mg/L，NAA 0.2mg/L時，花絲愈傷組織分化率最高，達到85.0％。所以，再生苗小鱗片的愈傷分化能力要比花絲強。 再生苗小鱗片的愈傷組織形成能力和分化能力都要比花絲高，而且不受季節(jié)的影響，隨時可以取材，所以最后選擇再生植株小鱗片作為外植體。

4、 2．抗生素篩選壓的確定從外植體的卡那霉素(Km)抗性篩選和頭孢霉素(Cef)抑菌試驗可知，小鱗片愈傷組織塊在Km125mg/L的濃度下分化率為2.5％，是亞致死濃度，適合作為小鱗片愈傷組織抗性篩選壓；當生根培養(yǎng)基中Km為125mg/L時，鱗芩葉開始變黃，不再有根生成，該濃度也適合作為篩選轉(zhuǎn)化植株生根的臨界濃度。Cef的濃度為400mg/L時抑菌而不傷害外植體，可做為抑菌濃度。 3．影響轉(zhuǎn)化率的因素隨著共培養(yǎng)基中NH<,4>N

5、O<,3>濃度的降低，農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率升高，當共培養(yǎng)基中完全去除NH<,4>NO<,3>，瞬時表達最高，可達到60％，所以共培養(yǎng)基選擇無NH<,4>NO<,3>的MS培養(yǎng)基。 以MS(pH5.8)為侵染液時轉(zhuǎn)化率為61.3％，以YEB(pDH7.0)為侵染液時轉(zhuǎn)化率為16.3％，前者遠遠高于后者，所以選擇MS為侵染液。 菌液濃度過低、侵染時間過短則農(nóng)桿菌對愈傷組織的侵染不夠充分，濃度過高、侵染時間過長則對愈傷組織塊有毒害作