刺槐遺傳轉化受體系統(tǒng)建立及轉PpNHX1基因.pdf

1、刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又名洋槐，豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)刺槐屬(Robinia L.)，落葉喬木，它適應性強，生長快，材質(zhì)好，用途廣，繁殖容易，具有一定耐鹽堿性，因此成為人工造林優(yōu)選樹種。但是其有限的耐鹽能力限制了它在重鹽堿區(qū)的應用。應用基因工程技術提高刺槐的耐鹽性是拓展其用于重鹽堿區(qū)綠化、造林的重要途徑。本試驗根據(jù)GenBank中公布的刺槐液泡膜上Na+/

2、H+逆向轉運蛋白基因序列設計了特異性引物，以鹽脅迫處理刺槐種子水培幼根誘導Na+/H+逆向轉運蛋白基因表達，由根總RNA反轉錄所得cDNA第一條鏈為模板克隆了RpNHX1基因編碼區(qū)序列，序列大小為1626bp，編碼542個氨基酸，通過酶切和連接反應構建了用于刺槐遺傳轉化的表達載體PBI121-RpNHX1并將其轉化土壤農(nóng)桿菌LBA4404獲得用于刺槐遺傳轉化的工程菌菌株。
　　試驗選用刺槐耐鹽無性系W009為材料，建立了以形成層為

3、受體的刺槐遺傳轉化系統(tǒng)。研究表明:以形成層為外植體誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為:1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖3％+水解乳蛋白100 mg/L+瓊脂6.5 g/L，愈傷誘導率最高可達92.5％。最適宜愈傷組織分化不定芽的培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1.5 mg/L+IBA0.3mg/L+TDZ0.06 mg/L+蔗糖3％+水解乳蛋白100 mg/L+瓊脂6.5 g/L，分化率最高達到87.5％，平均每個外

4、植體產(chǎn)生不定芽數(shù)目7.7個。以帶芽莖段為外植體誘導叢生芽，以及華等(1993)研究為參考進行了改進:MS+6-BA2.0 mg/L+IBA0.5 mg/L+TDZ0.05mg/L+蔗糖5％+水解乳蛋白100 mg/L+AC0.5 g/L+瓊脂6.5 g/L，分化率為67.3％，平均每個外植體產(chǎn)生不定芽4.7個。當產(chǎn)生的不定芽長至2-3 cm時轉接到MS空白培養(yǎng)基進行復壯后再接種到生根培養(yǎng)基上，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA0.2

5、 mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖1.5％+AC0.5 g/L+瓊脂6.5 g/L，瓶苗生根率可達90％-100％。
　　農(nóng)桿菌介導刺槐轉RpNHX1基因試驗中，將預培養(yǎng)1-2d的形成層和帶芽莖段在活化好的農(nóng)桿菌菌液中進行侵染，侵染時間10 min，菌液濃度以重懸后OD600=0.6為宜，侵染后的外植體在不含抗生素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d，共培養(yǎng)基中加入50 mg/L乙酰丁香酮能提高遺傳轉化效率。在研究不同抗生素對刺槐遺傳轉化受體

6、系統(tǒng)影響的試驗中，確定了以刺槐形成層為受體時最佳抑菌劑種類及其濃度以及選擇劑的劑量方案，結果表明:抗生素Cef對外植體生長抑制作用小，抑菌效果好，濃度為200mg/L時能完全抑制農(nóng)桿菌的生長。侵染后初次使用濃度為200 mg/L，隨繼代次數(shù)增加逐漸降低使用濃度直至完全除去。在誘導形成層愈傷組織分化的過程中添加100-125mg/L Kan能起到良好的篩選效果。侵染后的帶芽莖段進行培養(yǎng)時添加200 mg/L Cef進行抑菌，誘導分化不定芽