刺槐高頻再生體系的建立及轉(zhuǎn)Bt Cry1A基因的初步研究.pdf

1、刺槐，為豆科刺槐屬落葉喬木，原產(chǎn)北美。中國于1877年引入栽培，主要包括刺槐R.pseudoacacia L.和毛刺槐R.hispida L.兩種，常見于中部和東部，由于其生長迅速、木材堅(jiān)韌、紋理細(xì)致、有彈性、耐水濕、抗腐朽、根系發(fā)達(dá)，具根瘤，有一定的抗旱、抗煙、耐鹽堿能力（國家林業(yè)局國有林場和林木種苗工作總站，2001），現(xiàn)已成為華北、西北等地區(qū)優(yōu)良的保持水土、防風(fēng)固沙、改良土壤的優(yōu)質(zhì)樹種，深受群眾歡迎（荀守華等，2009）。刺槐還具

2、有花香濃郁、抗逆性強(qiáng)、病蟲害少、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)，且易于栽培、成活率高、綠化效果好，適宜于景觀綠化與經(jīng)濟(jì)用途（張亞玲等，2009）。 然而，近年來，生態(tài)環(huán)境等各方面的影響使刺槐也面臨一些嚴(yán)重的病蟲害：病害--紫紋羽病和爛皮病等；蟲害--白蟻、葉蟬、蚧、小皺蝽（葉）、豆莢螟蟲、麥蛾、小蜂（種子）等。而因?yàn)橐韵路N種原因，刺槐的轉(zhuǎn)基因工程研究進(jìn)展較緩慢。其一，一直以來，木本植物的遺傳轉(zhuǎn)化成功幾率都比較低，而刺槐為大型木本植物，基因組龐大，

3、外源基因很難插入并表達(dá)，即使有少數(shù)轉(zhuǎn)化成功的株系，在以后的繼代培養(yǎng)中也容易發(fā)生基因丟失或基因沉默等現(xiàn)象，這足木本植物轉(zhuǎn)基因研究中迄待解決的問題（荀守華等，2009）；其二，刺槐的遺傳轉(zhuǎn)化工作缺乏再生頻率高、重復(fù)性好的受體系統(tǒng)；其三，缺乏優(yōu)良的目的基因的克隆和啟動(dòng)子的構(gòu)建；其四，轉(zhuǎn)化頻率低、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，沒有形成第一代工程品種（鄭進(jìn)等，2005）。針對(duì)上述刺槐的廣泛用途及其病蟲害特點(diǎn)，更兼于豆科植物是被子植物第二大科，本實(shí)驗(yàn)展開了刺槐離體

4、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立及基因轉(zhuǎn)化的研究，擬建立一個(gè)高效的刺槐轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，并進(jìn)一步開展抗病蟲害的轉(zhuǎn)基因研究，旨在為刺槐及其他豆科植物的抗病蟲害方面提供借鑒及良好的應(yīng)用價(jià)值。 本實(shí)驗(yàn)首先以生長良好的刺槐植株的帶腋芽莖段為外植體，研究了在刺槐高頻再生體系的建立過程中不同基本培養(yǎng)基、不同激素濃度及其配比對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)、芽的分化及生根的影響；然后在得到高頻再生體系的基礎(chǔ)上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化Bt Cry1A抗蟲基因，以GUS染色組織分析

5、為依據(jù)探討了影響轉(zhuǎn)化效率的各種因素，建立了高效、可重復(fù)的基因轉(zhuǎn)化體系，為刺槐目的基因的導(dǎo)入打下了基礎(chǔ)。試驗(yàn)取得如下研究結(jié)果： 1.建立了刺槐高頻再生基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。在刺槐離體莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的過程中，芽的分化以MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.04mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂9g/L條件下分化率最高，每個(gè)外植體的平均分化芽數(shù)可達(dá)到7.3個(gè)；誘導(dǎo)生根以MS+NAA0.04mg/L+KT0.05mg/L+蔗糖30g

6、/L，效果最佳，生根率最高可達(dá)93.3，平均生根率達(dá)86.7％；在移栽生根苗時(shí)，先在溫室中馴化煉苗15～20天后移入大田，成活率可達(dá)83％以上。 2.以GUS染色檢測為依據(jù)初步建立了刺槐高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。以農(nóng)桿菌菌株LBA4404介導(dǎo)Bt Cry1A基因的轉(zhuǎn)化，首先確定了轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中最佳的抑菌素及其濃度和選擇壓：頭孢霉素（Cef）400mg/L即可有效地抑制農(nóng)桿菌菌株LBA4404的生長；卡那霉素（Km）50mg/L為選擇壓較適宜