歐李再生體系的建立和NAC1基因功能的初步研究.pdf

1、歐李(Cerasus humilis)為薔薇科櫻桃屬果樹，是多年生落葉矮生灌木，它抗寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿，具有固土保水、防止沙塵、減少地表徑流的作用，適應(yīng)性很強(qiáng)，是優(yōu)良的生態(tài)樹種。但目前有關(guān)歐李的抗旱機(jī)制還尚不明確，本研究首先通過組織培養(yǎng)技術(shù)成功建立了歐李的再生體系，試驗(yàn)分別以葉片、莖段為外植體，通過誘導(dǎo)愈傷組織和促進(jìn)腋芽生枝能力兩種途徑對(duì)歐李（懷柔）進(jìn)行快繁。同時(shí)，基于歐李抗旱性強(qiáng)的特點(diǎn)，我們從前期獲得的歐李轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)出發(fā)，從歐李

2、葉片中克隆并獲得全長(zhǎng)NAC基因，并初步進(jìn)行了功能的研究。本研究一方面通過成功建立歐李快繁技術(shù)，為后續(xù)歐李的遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，另一方面通過對(duì)NAC基因的初步研究，為揭示歐李抗旱的分子機(jī)制提供線索。主要研究結(jié)果如下:
　　1、通過誘導(dǎo)愈傷組織成功建立了歐李的再生體系
　　(1)外植體的最適消毒條件是:外植體在流水下沖洗30min，75％酒精表面消毒1.0min，1％NaClO消毒4min，無(wú)菌水涮洗6-7次。
　

3、　(2)以葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為:MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+1.0mg/L6-BA+0.6mg/LNAA;以莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為:MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0.5mg/L6-BA+0.8mg/LNAA。
　　(3)最適愈傷組織擴(kuò)增PGR濃度為:0.5mg/L6-BA+0.6mg/L2.4-D。
　　(4)由愈傷組織再分化為芽的最適PGR濃度為:5.0mg/L6-BA+

4、0.9mg/L NAA。
　　(5)促進(jìn)腋芽生枝芽的最適培養(yǎng)基為:MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+2.0mg/L6-BA+0.9mg/L NAA。
　　(6)由芽誘導(dǎo)生根階段最佳最適培養(yǎng)基為:1/2MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂粉+0.5mg/LNAA。
　　2、從歐李葉片中克隆并獲得全長(zhǎng)NAC基因命名為ChNAC1(KP314213.1)，該基因全長(zhǎng)為997bp，開放閱讀框894bp，編碼297個(gè)氨基酸，預(yù)

5、測(cè)蛋白分子量為33.94kD，理論等電點(diǎn)pI為8.09，定位于細(xì)胞核。
　　3、我們進(jìn)一步融合CaMV35S啟動(dòng)子構(gòu)建ChNAC1基因的高效植物表達(dá)載體，通過凍融法將載體pROK2-ChNAC1轉(zhuǎn)入感受態(tài)農(nóng)桿菌EHA105中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，構(gòu)建ChNAC1高效表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥，選擇性培養(yǎng)基篩選獲得兩株轉(zhuǎn)基因株系line1和line4，ChNA C1特異性引物PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物為陽(yáng)性。對(duì)獲得純系轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行20