小麥TaRanBP基因功能的初步分析.pdf

1、小G蛋白(small GTPases)是真核生物中廣泛存在的一類調(diào)節(jié)各種生命活動(dòng)的信號(hào)分子。根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能的不同，小G蛋白家族成員可分成五個(gè)亞家族，分別為Ras，Rab，Rho，Arf和Ran。五類小G蛋白通過(guò)其活化態(tài)(GTP結(jié)合態(tài))和非活化態(tài)(GDP結(jié)合態(tài))的相互轉(zhuǎn)換行使著各種功能。Pas GTPases在酵母和哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖過(guò)程； Rho GTPases調(diào)控肌動(dòng)蛋白重組過(guò)程，并參與MAP激酶的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程等； Rab G

2、TPases和ArfGTPases分別在膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起著不同的重要作用；而Ran GTPases則在核孔位置調(diào)節(jié)著蛋白和RNA分子的運(yùn)輸過(guò)程。
　　 小G蛋白附屬蛋白調(diào)節(jié)著小G蛋白活化態(tài)與非活化態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，其中鳥核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)可以催化小G蛋白轉(zhuǎn)換為GTP結(jié)合形式，即活化態(tài)；而GTPase激活蛋白(GTPase-activating protei

3、ns，GAPs)和小G蛋白結(jié)合蛋白(small GTPases binding proteins)可以激活小G蛋白自身的水解活性，從而將其轉(zhuǎn)變成非活化態(tài)形式。
　　 相比其它小G蛋白，Ran GTPases及其附屬蛋白在真核生物中的研究相對(duì)較少。已有的成果表明它們主要在核質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中及對(duì)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起調(diào)節(jié)作用。而針對(duì)Ran GTPases及其附屬蛋白在真核生物尤其是高等植物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中的作用，目前報(bào)道還很少。
　　

4、 為了揭示Ran結(jié)合蛋白(Ran binding protein，RanBP)在植物發(fā)育過(guò)程中的作用，本文通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段對(duì)其功能進(jìn)行了研究。在此之前，本實(shí)驗(yàn)室已從小麥cDNA文庫(kù)中成功克隆Ran結(jié)合蛋白基因：TaRanBP。該基因cDNA全長(zhǎng)1035 bp，編碼207個(gè)氨基酸。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉圓片法，分別用正義、反義及TaRanBP與GFP融合蛋白等表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，并成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。亞細(xì)胞定位觀察發(fā)現(xiàn)TaRanBP蛋白主要定位于

5、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，尤其是在核膜附近富集。生理學(xué)和細(xì)胞學(xué)等方面的研究分析發(fā)現(xiàn)，TaRanBP基因在煙草個(gè)體發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生重要作用。過(guò)量表達(dá)TaRanBP基因的轉(zhuǎn)基因植株在一定數(shù)量上表現(xiàn)出愈合的花冠筒上出現(xiàn)不同程度開裂，花冠筒上有附生舌狀花瓣，及帶有花瓣?duì)铑伾幕ㄝ嗟犬惓；ū硇?。同時(shí)，轉(zhuǎn)反義基因在一定程度上促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株初生主根的生長(zhǎng)(為對(duì)照煙草的2.3倍)，而轉(zhuǎn)正義基因煙草與對(duì)照煙草的初生主根長(zhǎng)度差異不明顯。用碘化丙錠(Propidium Io

6、dide，PI)進(jìn)行根部細(xì)胞染色。觀察發(fā)現(xiàn)，不同的轉(zhuǎn)基因煙草與對(duì)照煙草之間在根的各個(gè)不同形態(tài)區(qū)域的細(xì)胞大小差異不明顯，推測(cè)根長(zhǎng)的差異可能是由于整體細(xì)胞數(shù)目變化的原因?qū)е?。向重力性?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)反義基因煙草幼苗較對(duì)照煙草的向重力性反應(yīng)增加，而轉(zhuǎn)正義基因的則表現(xiàn)為降低。激素吲哚乙酸(Indoleacetic Acid，IAA)的添加處理可以恢復(fù)轉(zhuǎn)反義基因煙草的向重力性異常表型，而對(duì)轉(zhuǎn)正義基因煙草幾乎無(wú)影響。添加激動(dòng)素(Kinetin，KT)的