小麥抗條銹病相關(guān)基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、小麥（T.aestivumL）條銹病是由條形柄銹菌（Puccinia sriiformisf.sp.tritici）引起的一種流行廣、危害重的世界性小麥真菌病害。實(shí)踐證明，選育和合理利用抗病品種是防治小麥條銹病最安全、經(jīng)濟(jì)、有效的方法。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所選育的普通小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系（“92R”系列）不僅對(duì)白粉病表現(xiàn)廣譜抗性，而且在云南、四川、陜西等條銹高發(fā)區(qū)多年種植，對(duì)條銹病也表現(xiàn)廣譜抗性，高抗目前我國(guó)多數(shù)強(qiáng)毒流行小種

2、，含此抗條銹病基因的品系是我國(guó)當(dāng)前廣泛使用的有效抗源之一，國(guó)際小麥基因命名委員會(huì)已將該條銹病抗性基因正式定名為Yr26。因此，開展Yr26與條銹病互作機(jī)理及重要抗條銹病相關(guān)基因的克隆，對(duì)于條銹病抗病育種具有重要意義。鑒于小麥基因組龐大和復(fù)雜性，以及Yr26又定位于1B染色體近著絲粒區(qū)域，試圖通過傳統(tǒng)的圖位克隆方法克隆Yr26尤為困難。為此，本研究主要通過小麥基因芯片技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組水平上系統(tǒng)解析小麥與條銹菌互作的基因表達(dá)特征、克隆抗條銹相關(guān)

3、基因、利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究其功能，為闡明小麥抗條銹病的分子機(jī)理和開展抗條銹病小麥基因工程育種提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本論文主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.小麥-條銹菌互作基因芯片表達(dá)譜分析
　　 利用基因芯片技術(shù)，獲得了含抗條銹病基因Yr26小麥92R137、R236（揚(yáng)麥158的近等基因系）、感病小麥揚(yáng)麥158在條銹菌誘導(dǎo)0、12和36小時(shí)的基因表達(dá)譜。利用SAM(SignificanceAnalysis

4、of Microarrays)軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，在FDR(FalseDiscovery Rate)＜0.1時(shí)，在誘導(dǎo)組合中篩選出上調(diào)倍數(shù)大于2的共同差異表達(dá)基因299個(gè)，對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋、分類分析，有功能注釋的基因(homology proteins)有152個(gè)(50.8％)，假想或推測(cè)性蛋白(hypothetical/ predictedprotein)為51個(gè)(17.1％)，而BlastX比對(duì)后沒有顯著匹配的

5、序列(no hits)96個(gè)(32.1％);其中上調(diào)表達(dá)且具有功能注釋的41個(gè)基因分別與轉(zhuǎn)運(yùn)、初級(jí)代謝、抗病與防御、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)等相關(guān)，并以抗病及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因?yàn)橹?，推測(cè)這些基因參與了小麥抗條銹病反應(yīng)。
　　 2.候選基因的克隆與特征分析
　　 根據(jù)基因芯片的雜交結(jié)果，選擇了三個(gè)在誘導(dǎo)組合和非誘導(dǎo)組合中上調(diào)表達(dá)的基因進(jìn)行克隆和特征分析。
　　 探針Ta.22666.2.S1_at預(yù)測(cè)為類受體蛋白，利用RACE技

6、術(shù)從抗條銹病小麥92R137中克隆出Ta.22666.2.S1_at的同源基因，該基因全長(zhǎng)1154 bp，無內(nèi)含子，ORF801 bp編碼266個(gè)氨基酸。該編碼蛋白包含N端信號(hào)肽、胞外LRR區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)短肽結(jié)構(gòu)域，為典型的LRR-TM胞外受體蛋白(RLP)。本研究首次在小麥中克隆此類基因，因此，將該基因命名為TaRLP1.1。TaRLP1.1以基因家族形式存在，在小麥中至少存在8種同源基因，且定位于小麥第三部分同源群。TaRLP

7、1基因家族序列分析表明，基因家族間序列變異主要以單堿基突變?yōu)橹?，同時(shí)也涉及短序列的插入、缺失以及基因間的重組?？?、感材料受條銹菌誘導(dǎo)后的cDNA測(cè)序分析表明，TaRLP1.1是含Yr26抗病材料中特異誘導(dǎo)表達(dá)的主要類型，而感病材料中主要以無義突變TaRLP1800-1拷貝為主。同時(shí)，激素誘導(dǎo)表達(dá)分析結(jié)果表明，TaRLP1.1主要受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因可能通過SA介導(dǎo)的信號(hào)途徑響應(yīng)條銹病的抗性反應(yīng)。
　　 Ta.1763.

8、2.S1_at預(yù)測(cè)為GTP結(jié)合蛋白(GTP-binding protein)，利用RACE方法從92R137中獲得了其同源基因，該基因cDNA全長(zhǎng)1040 bp，0RF為660bp，基因組DNA全長(zhǎng)中包含五個(gè)內(nèi)含子。該基因與短柄草RABC1、玉米R(shí)AB-18、擬南芥AtRAB-C2A等同源性高達(dá)90％以上，因此將其命名為TaRAB。TaRAB被定位于小麥染色體7B上，其表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。TaRAB在92R137中受條銹菌誘

9、導(dǎo)早期表達(dá)，推測(cè)TaRAB可能與小麥抗銹病途徑信號(hào)傳遞、抗病物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)。
　　 Ta.941.1.A1_at預(yù)測(cè)為類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinase），利用RACE方法從92R137中獲得了其同源基因，該基因全長(zhǎng)1382 bp，無內(nèi)含子，ORF1239 bp編碼412aa。SMART分析表明，該序列編碼蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性位點(diǎn)，屬于激酶類基因，將其命名為TaSTPK。比對(duì)分析表

10、明該基因的激酶域同其他物種的激酶域同源性較低(48-59％)。染色體定位結(jié)果表明TaSTPK定位于小麥5B染色體上，基因產(chǎn)物分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。TaSTPK受條銹菌誘導(dǎo)，并持續(xù)表達(dá)，推測(cè)TaSTPK參與了Yr26介導(dǎo)的抗條銹菌反應(yīng)。
　　 3.候選基因的功能分析
　　 利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)和轉(zhuǎn)基因方法，分別從基因沉默水平和超表達(dá)水平對(duì)候選基因進(jìn)行了功能分析。VIGS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TaRLP1.1和TaR

11、AB分別被沉默后的92R137表現(xiàn)出不同程度的感病癥狀，對(duì)CYR32的反應(yīng)型由0-1級(jí)轉(zhuǎn)為4～6級(jí)，組織學(xué)觀察結(jié)果與表型鑒定結(jié)果一致。TaS TP被沉默后的92R137對(duì)CYR32的反應(yīng)型由0-1級(jí)轉(zhuǎn)為3級(jí)，雖然仍為抗病反應(yīng)型，但葉片壞死面積相對(duì)較小，且在褪綠斑周圍產(chǎn)生少量夏孢子堆。轉(zhuǎn)基因超表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)化TaSTPK和TaRAB基因的植株感病性沒有發(fā)生明顯改變，仍表現(xiàn)與感病對(duì)照一致感病反應(yīng)。而轉(zhuǎn)TaRLP1.1基因植株產(chǎn)生明顯的