小麥抗條銹病相關(guān)基因的克隆與功能初步分析.pdf

1、小麥（T.aestivumL）條銹病是由條形柄銹菌（Puccinia sriiformisf.sp.tritici）引起的一種流行廣、危害重的世界性小麥真菌病害。實踐證明，選育和合理利用抗病品種是防治小麥條銹病最安全、經(jīng)濟、有效的方法。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細胞遺傳所選育的普通小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系（“92R”系列）不僅對白粉病表現(xiàn)廣譜抗性，而且在云南、四川、陜西等條銹高發(fā)區(qū)多年種植，對條銹病也表現(xiàn)廣譜抗性，高抗目前我國多數(shù)強毒流行小種

2、，含此抗條銹病基因的品系是我國當前廣泛使用的有效抗源之一，國際小麥基因命名委員會已將該條銹病抗性基因正式定名為Yr26。因此，開展Yr26與條銹病互作機理及重要抗條銹病相關(guān)基因的克隆，對于條銹病抗病育種具有重要意義。鑒于小麥基因組龐大和復(fù)雜性，以及Yr26又定位于1B染色體近著絲粒區(qū)域，試圖通過傳統(tǒng)的圖位克隆方法克隆Yr26尤為困難。為此，本研究主要通過小麥基因芯片技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組水平上系統(tǒng)解析小麥與條銹菌互作的基因表達特征、克隆抗條銹相關(guān)

3、基因、利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究其功能，為闡明小麥抗條銹病的分子機理和開展抗條銹病小麥基因工程育種提供實驗依據(jù)。本論文主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.小麥-條銹菌互作基因芯片表達譜分析
　　 利用基因芯片技術(shù)，獲得了含抗條銹病基因Yr26小麥92R137、R236（揚麥158的近等基因系）、感病小麥揚麥158在條銹菌誘導(dǎo)0、12和36小時的基因表達譜。利用SAM(SignificanceAnalysis

4、of Microarrays)軟件對芯片數(shù)據(jù)進行分析，在FDR(FalseDiscovery Rate)＜0.1時，在誘導(dǎo)組合中篩選出上調(diào)倍數(shù)大于2的共同差異表達基因299個，對這些差異表達基因進行GO功能注釋、分類分析，有功能注釋的基因(homology proteins)有152個(50.8％)，假想或推測性蛋白(hypothetical/ predictedprotein)為51個(17.1％)，而BlastX比對后沒有顯著匹配的

5、序列(no hits)96個(32.1％);其中上調(diào)表達且具有功能注釋的41個基因分別與轉(zhuǎn)運、初級代謝、抗病與防御、轉(zhuǎn)錄、信號傳導(dǎo)等相關(guān)，并以抗病及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因為主，推測這些基因參與了小麥抗條銹病反應(yīng)。
　　 2.候選基因的克隆與特征分析
　　 根據(jù)基因芯片的雜交結(jié)果，選擇了三個在誘導(dǎo)組合和非誘導(dǎo)組合中上調(diào)表達的基因進行克隆和特征分析。
　　 探針Ta.22666.2.S1_at預(yù)測為類受體蛋白，利用RACE技

6、術(shù)從抗條銹病小麥92R137中克隆出Ta.22666.2.S1_at的同源基因，該基因全長1154 bp，無內(nèi)含子，ORF801 bp編碼266個氨基酸。該編碼蛋白包含N端信號肽、胞外LRR區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)短肽結(jié)構(gòu)域，為典型的LRR-TM胞外受體蛋白(RLP)。本研究首次在小麥中克隆此類基因，因此，將該基因命名為TaRLP1.1。TaRLP1.1以基因家族形式存在，在小麥中至少存在8種同源基因，且定位于小麥第三部分同源群。TaRLP

7、1基因家族序列分析表明，基因家族間序列變異主要以單堿基突變?yōu)橹?，同時也涉及短序列的插入、缺失以及基因間的重組。抗、感材料受條銹菌誘導(dǎo)后的cDNA測序分析表明，TaRLP1.1是含Yr26抗病材料中特異誘導(dǎo)表達的主要類型，而感病材料中主要以無義突變TaRLP1800-1拷貝為主。同時，激素誘導(dǎo)表達分析結(jié)果表明，TaRLP1.1主要受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達，推測該基因可能通過SA介導(dǎo)的信號途徑響應(yīng)條銹病的抗性反應(yīng)。
　　 Ta.1763.

8、2.S1_at預(yù)測為GTP結(jié)合蛋白(GTP-binding protein)，利用RACE方法從92R137中獲得了其同源基因，該基因cDNA全長1040 bp，0RF為660bp，基因組DNA全長中包含五個內(nèi)含子。該基因與短柄草RABC1、玉米RAB-18、擬南芥AtRAB-C2A等同源性高達90％以上，因此將其命名為TaRAB。TaRAB被定位于小麥染色體7B上，其表達產(chǎn)物定位于細胞質(zhì)和細胞核中。TaRAB在92R137中受條銹菌誘

9、導(dǎo)早期表達，推測TaRAB可能與小麥抗銹病途徑信號傳遞、抗病物質(zhì)運輸有關(guān)。
　　 Ta.941.1.A1_at預(yù)測為類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinase），利用RACE方法從92R137中獲得了其同源基因，該基因全長1382 bp，無內(nèi)含子，ORF1239 bp編碼412aa。SMART分析表明，該序列編碼蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性位點，屬于激酶類基因，將其命名為TaSTPK。比對分析表

10、明該基因的激酶域同其他物種的激酶域同源性較低(48-59％)。染色體定位結(jié)果表明TaSTPK定位于小麥5B染色體上，基因產(chǎn)物分布于細胞質(zhì)和細胞核中。TaSTPK受條銹菌誘導(dǎo)，并持續(xù)表達，推測TaSTPK參與了Yr26介導(dǎo)的抗條銹菌反應(yīng)。
　　 3.候選基因的功能分析
　　 利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)和轉(zhuǎn)基因方法，分別從基因沉默水平和超表達水平對候選基因進行了功能分析。VIGS實驗結(jié)果顯示:TaRLP1.1和TaR

11、AB分別被沉默后的92R137表現(xiàn)出不同程度的感病癥狀，對CYR32的反應(yīng)型由0-1級轉(zhuǎn)為4～6級，組織學(xué)觀察結(jié)果與表型鑒定結(jié)果一致。TaS TP被沉默后的92R137對CYR32的反應(yīng)型由0-1級轉(zhuǎn)為3級，雖然仍為抗病反應(yīng)型，但葉片壞死面積相對較小，且在褪綠斑周圍產(chǎn)生少量夏孢子堆。轉(zhuǎn)基因超表達實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)化TaSTPK和TaRAB基因的植株感病性沒有發(fā)生明顯改變，仍表現(xiàn)與感病對照一致感病反應(yīng)。而轉(zhuǎn)TaRLP1.1基因植株產(chǎn)生明顯的