TcLr24小麥抗葉銹病相關(guān)基因的分離與功能分析.pdf

1、由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起的小麥葉銹病是一種在世界范圍內(nèi)普遍流行的氣傳性病害,嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)。選育并合理利用抗病品種是防治麥類銹病危害最經(jīng)濟(jì)、安全、有效的途徑之一。因此,利用和發(fā)掘抗葉銹資源,延長品種的抗葉銹性壽命,成為小麥葉銹病防治的一項(xiàng)任務(wù)。本研究選擇當(dāng)前在我國抗性較好的小麥抗葉銹病近等基因系TcLr24為研究對(duì)象,應(yīng)用同源序列法和cDNA-AFLP技術(shù)對(duì)其進(jìn)行抗病相關(guān)基因的研究,利用熒光實(shí)時(shí)定量PC

2、R進(jìn)行表達(dá)分析,同時(shí)利用BSMV VIGS技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行了初步的功能驗(yàn)證。主要結(jié)果如下:
　　 1根據(jù)已克隆植物抗病基因NBS保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)引物,從攜帶小麥抗葉銹病基因Lr24的回交6代近等基因系材料TcLr24中獲得了1個(gè)通讀的小麥抗病基因同源片段RGA1。該片段含有NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域,具有抗病基因NBS特征結(jié)構(gòu)域(P環(huán)、激酶2、激酶3a等)。
　　 2以獲得的RGA1片段為靶序列,利用RACE技術(shù)獲得了2822b

3、p的TcLr24 cDNA全長RGA1。RGA1包含2397bp的開放閱讀框,編碼799個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸序列,RGA1編碼產(chǎn)物具有NBS、LRR等抗病基因保守結(jié)構(gòu)域,與多個(gè)已知植物抗病基因的功能相應(yīng)區(qū)域一致。Southern雜交結(jié)果表明,其在TcLr24基因組中為單拷貝。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)RGA1基因的表達(dá)情況研究表明,該基因?yàn)榻M成型表達(dá)。BSMV VIGS功能驗(yàn)證沒有發(fā)生表型改變。
　　 3本研究利用cDNA-AFLP技術(shù)篩選

4、了84對(duì)引物能夠在小麥近等基因系TcLr24和感病對(duì)照Thatcher之間揭示出多態(tài)性,根據(jù)基因表達(dá)與否以及表達(dá)量,獲得了9種不同差異表達(dá)的多態(tài)性條帶類型,分別代表了不同狀態(tài)下測試材料的表達(dá)狀況。
　　 4成功克隆和測序了121個(gè)差異表達(dá)片段(Transcript-derived fragments,TDFs),測序結(jié)果在NCBI上應(yīng)用BLASTx比對(duì)進(jìn)行推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列的相似性分析,結(jié)果共有32條為功能已知的同源序列,占總數(shù)的

5、27％；比對(duì)上功能未知的序列37條占總數(shù)的30％；沒有比對(duì)上的序列45條占總數(shù)的37％。已知功能序列的TDFs涉及初級(jí)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)、抗病與防御、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量代謝、蛋白儲(chǔ)運(yùn)等。
　　 5從差異表達(dá)并測序的片段中選取了9個(gè)進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析,證實(shí)了這些基因差異表達(dá)是由于葉銹菌誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果,發(fā)生在小麥與葉銹菌互作的早期。與cDNA-AFLP表達(dá)基本一致,說明利用cDNA-AFLP分析基因的表達(dá)是可

6、靠的。
　　 6利用RACE的方法獲得了3個(gè)激酶基因,包括TaSTK(1475bp),TaRLPK(2398bp),TaLRRK(2038 bp),分別編碼絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶(408aa),類受體激酶(656aa),LRR-受體激酶(595aa)。InterProScan分析表明,它們所編碼的蛋白都具有典型的蛋白激酶的核心區(qū)域,屬于激酶類基因,并且這三個(gè)蛋白的磷酸化作用需要依賴ATP。經(jīng)Psort預(yù)測顯示,TaSTK編碼的蛋

7、白最可能分布在葉綠體基質(zhì)中,幾率為85.4％,而TaRLPK和TaLRRK編碼的蛋白分布在質(zhì)膜中的可能性較大,幾率分別為51.4％和46％,表明TaRLPK和TaLRRK編碼的蛋白是膜蛋白。氨基酸比對(duì)及進(jìn)化樹分析表明,TaSTK,TaRLPK,TaLRRK分別與大麥、水稻、小麥等激酶具有較高的相似性。
　　 7利用BSMV VIGS基因沉默技術(shù)對(duì)3個(gè)激酶基因進(jìn)行了初步的功能分析。結(jié)果表明3個(gè)基因被沉默后發(fā)生了不同程度的表型變化,

8、并且組織學(xué)觀察的結(jié)果與其表型變化一致。其中,TaSTK基因被沉默的小麥葉片接種葉銹菌后表型由“；"轉(zhuǎn)變成“1”,組織學(xué)中觀察到,接種葉銹菌120hpi,寄主細(xì)胞壞死,但菌絲仍然擴(kuò)展明顯。而TaRLPK和TaLRRK基因被沉默的小麥葉片在接種葉銹菌后表型由“；”轉(zhuǎn)變成“2”,表現(xiàn)為中抗反應(yīng)。120hpi組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),葉銹菌侵染后形成少量壞死,但是這些壞死不能完全抑制病原菌的生長,表現(xiàn)出對(duì)葉銹菌的中度抗性反應(yīng)。研究表明這三個(gè)激酶基因參與了