F10基因功能初步研究.pdf

1、目的：在研究葡萄胎發(fā)病機制的過程中，發(fā)現(xiàn)了一系列葡萄胎組織高表達的基因，其中F10是一個未知功能的新基因。在前期工作中判斷F10與滋養(yǎng)細胞腫瘤及腺癌相關(guān)，但在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的意義未知，為此，我們對其進行了初步探索：1.觀察F10在組織中的分布；2.F10在細胞內(nèi)的定位；3.了解F10表達產(chǎn)物對細胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。期望通過以上分析，了解該基因的生物學(xué)功能，以及在腫瘤形成中可能的作用。 方法：1.F10基因克隆和序列分析

2、提取葡萄胎組織RNA，以之為模板通過RT-PCR擴增出F10的完整編碼序列，將其連接至pMD18-T載體，酶切鑒定后測序，并對序列進行生物信息學(xué)分析。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建F10的真核表達載體pRC/CMV2-F10(包括正向和反向真核表達載體)和原核表達載體pET-GST/F10。 2.F10的組織分布利用原位雜交和免疫組化方法在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平研究基因表達的組織特異性。以pRC/CMV2-F10(-)質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄制備地高辛標(biāo)

3、記的mRNA探針用于原位雜交實驗。pET-GST/F10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在IPTG誘導(dǎo)下表達F10蛋白，親和層析純化蛋白，純化的蛋白免疫動物制備多克隆抗體，用于免疫組化的方法分析F10蛋白在多種器官和組織的表達水平。 3.F10基因的細胞內(nèi)定位和對重要信號通路的影響構(gòu)建F10與pEGFP的真核融合表達載體pEGFP/F10，將pEGFP/F10瞬時轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞MCF-7后觀察F10在活細胞中的定位。將pRC/CMV2-F

4、10(+)、pRC/CMV2-F10(-)、pRC/CMV2與報道系統(tǒng)-3-AP1-luc、NFkb-luc瞬時共轉(zhuǎn)染16HBE細胞，測定螢火蟲熒光素酶活性，利用螢火蟲熒光素酶報道系統(tǒng)分析F10對細胞重要信號通路的作用。 結(jié)果：1.成功擴增F10完整編碼序列，總長度為980bp，與pMD18-T載體連接后酶切，結(jié)果符合預(yù)期設(shè)計，并且有正、反連接的pMD18-T/F10載體。經(jīng)測序后的F10序列網(wǎng)上提交，登陸號是AB196290

5、。將F10序列與GeneBank上提供的核酸序列相比較，所獲得的高度同源基因均為假想基因，或者基因組序列的一部分，功能不明。此外，成功構(gòu)建了F10的真核和原核表達重組質(zhì)粒。 2.以pRC/CMV2-F10(-)質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄獲得F10基因的mRNA探針，探針標(biāo)記效率可以達到原位雜交要求。原核表達的GST-F10融合蛋白分子量正確，并以HIS-tag抗體進行westernblot驗證表達序列正確；以純化的F10/GST融合蛋

6、白免疫新西蘭大白兔，獲得的抗血清ELISA檢測抗體效價達1：20000，westernblot分析靈敏度至少達20ng。原位雜交和免疫組化發(fā)現(xiàn)F10基因在食道、結(jié)腸、胰腺、神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星細胞、子宮頸、子宮等正常組織和結(jié)腸腺癌、食道、子宮鱗癌等癌組織中均呈陽性表達，免疫組化還發(fā)現(xiàn)F10蛋白在子宮頸和食道粘膜的復(fù)層扁平上皮細胞以及腸道的單層柱狀上皮細胞中的分布存在極性。 3.酶切和測序結(jié)果證實成功構(gòu)建了pEGFP/F10的融合表達載體

7、，將pEGFP/F10瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，在熒光顯微鏡下觀察可見F10主要分布在細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)非均勻分布，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的特異性熒光染料有重疊，以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重疊的范圍最為明顯。也有小量細胞中F10作用在細胞核，或者核漿均有分布。利用螢火蟲熒光素酶報道系統(tǒng)AP1-luc、NFkb-luc分析F10在細胞增殖分化中的作用，可見在轉(zhuǎn)染F1024h后的細胞中，luc活性較轉(zhuǎn)染了反義F10及空載體的細胞顯著下降，但后兩者無顯著

8、性差異；而在轉(zhuǎn)染后36h和48h，三者luc活性均下降，無顯著性差異。 結(jié)論：1.F10蛋白是在多種組織普遍表達的細胞內(nèi)蛋白，并在腫瘤組織中有增強表達的-4-趨勢。其中在復(fù)層扁平上皮、神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星細胞、胰腺以及消化道黏膜表達最為強烈；在正常的消化道和子宮頸粘膜中F10蛋白分布出現(xiàn)極性，說明F10不是一種腫瘤特異性基因，更可能與細胞分泌、代謝或者極性相關(guān)。 2.F10主要分布在細胞質(zhì)中，可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細