小麥春化響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組及相關(guān)基因功能分析.pdf

1、春化是小麥生長發(fā)育過程中重要的調(diào)控環(huán)節(jié)，通過低溫春化過程可以有效調(diào)控小麥幼穗的發(fā)育及分化進(jìn)程，進(jìn)而直接影響到小麥的抗凍能力和籽粒產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，開展小麥春化分子調(diào)控機(jī)制的研究對于小麥抗凍和高產(chǎn)分子育種研究均具有重要意義。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，利用Illumina高通量測序技術(shù)，系統(tǒng)分析了小麥對春化響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組及其在春化過程中的差異表達(dá)譜，并對與春化調(diào)控密切相關(guān)的候選基因進(jìn)行了初步的功能鑒定，主要研究結(jié)果如下：
　　1、春化響

2、應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組及差異表達(dá)譜分析
　　以春性品種遼春10號和冬性品種京841作為試驗(yàn)材料，利用Illumina高通量第二代測序技術(shù)進(jìn)行了深度測序分析，得到了69,751,192 raw reads和5,787,106,380(5.78Gb)核苷酸。基于序列同源性，138,062個(gè)序列分為61個(gè)功能集合，56,868個(gè)組裝序列歸屬于25個(gè)COG聚類。從遼春10號和京841春化、未春化幼芽，春化、未春化二棱期的樣品中構(gòu)建了8個(gè)DGEs，獲得

3、了一批差異表達(dá)的基因。利用qRT-PCR技術(shù)，對部分差異表達(dá)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了驗(yàn)證分析，包括9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、7個(gè)甲基化相關(guān)基因、2個(gè)開花調(diào)控相關(guān)基因、2個(gè)春化相關(guān)基因、1個(gè)低溫響應(yīng)基因、1個(gè)脫水素基因、1個(gè)冰晶重結(jié)晶抑制蛋白和1個(gè)ABA相關(guān)基因。表達(dá)特性分析顯示，qRT-PCR的分析結(jié)果與DGE獲得的表達(dá)模式相一致，進(jìn)一步證實(shí)通過高通量技術(shù)獲得的基因差異表達(dá)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。
　　2、春化響應(yīng)候選基因的篩選及其時(shí)空表達(dá)模式分析

4、　　通過對J-NV&J-V和LC-NV&LC-V的比較，得到京841特異表達(dá)基因29498個(gè)，根據(jù)功能注釋，篩選出8類共計(jì)639個(gè)與春化響應(yīng)相關(guān)的候選基因；分別從這8類中挑選差異倍數(shù)較高的基因，共計(jì)17個(gè)，對其在春化過程中的的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，包括6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、3個(gè)甲基化相關(guān)基因、2個(gè)開花調(diào)控相關(guān)基因、2個(gè)春化相關(guān)基因、1個(gè)低溫響應(yīng)基因、1個(gè)脫水素基因、1個(gè)冰晶重結(jié)晶抑制蛋白和1個(gè)ABA相關(guān)基因。從這17個(gè)基因中挑選下調(diào)差異倍數(shù)10倍

5、以上且長度大于1000bp的基因，共計(jì)6個(gè)，分別是CL8746.Contig1（TF：B-box transcription factor）、CL18846.Contig2（TF：zinc finger protein）、Unigene10196（TF）、CL12788.Contig3（TF：zinc finger protein）、CL14010.Contig2（vernalization）、Unigene16777（methylat

6、ion），另從J-NV&J-V的差異基因中挑選出1個(gè)差異倍數(shù)10倍以上，長度超過1000bp的基因CL176.Contig1（CDT1-like protein）在京841中進(jìn)行cDNA克隆及序列分析。篩選的7個(gè)基因涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長周期、衰老及防御相關(guān)、DNA甲基化和有絲分裂，這些過程可能與春化響應(yīng)有密切的聯(lián)系。對7個(gè)基因在春化過程中的動態(tài)表達(dá)模式進(jìn)行了分析，7個(gè)基因總體表達(dá)趨勢均為下調(diào)，但CL8746.Contig1在春化第6天

7、上調(diào)表達(dá)，隨后下調(diào)；Unigene16777和CL176.Contig1表現(xiàn)出波動下調(diào)；其余基因均表現(xiàn)出持續(xù)下調(diào)。上述研究結(jié)果顯示，這些候選基因在春化響應(yīng)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，可能涉及到多個(gè)不同的基因表達(dá)調(diào)控途徑。
　　3、重點(diǎn)候選基因的功能鑒定
　　利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，以大麥條紋花葉病毒（BMSV）為載體，建立了以京841為實(shí)驗(yàn)材料的小麥VIGS基因功能鑒定技術(shù)體系。在此基礎(chǔ)上，對春化響應(yīng)的7個(gè)候選

8、基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證分析。結(jié)果顯示，本研究中構(gòu)建的BSMV重組載體侵染小麥葉片后，對植株的幼穗發(fā)育進(jìn)程有不同程度的影響。空白、陽性和陰性對照之間差異不顯著，但與目的基因相比表現(xiàn)出顯著的差異?？瞻讓φ諒某雒绲蕉馄谛枰?5.0天，而BSMV重組載體接種的植株最長僅需66.5天，最短為59.8天，大大縮短了出苗到二棱期的生育進(jìn)程。上述研究顯示，7個(gè)候選基因在小麥開花調(diào)控過程中具有開花抑制效應(yīng)，關(guān)于其在小麥春化過程中的具體生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一

9、步研究。
　　4、春化基因VRN1和VER2的克隆及表達(dá)特性分析
　　VRN1和VER2是已知的春化基因，本研究中篩選的兩個(gè)基因CL19305.Contig2和CL14010.Contig2分別與VRN1和VER2100％相似。本研究以8個(gè)不同發(fā)育特性小麥品種cDNA為模板，克隆VRN-A1和VER2基因的完整ORF，并分析其序列特性，結(jié)果表明，這兩個(gè)基因在8個(gè)品種中的序列高度相似。利用qRT-PCR進(jìn)行春化過程中動態(tài)表達(dá)模

10、式的分析，冬性品種VRN1基因在春化前期表達(dá)量極低，隨著春化時(shí)間延長呈波動上調(diào)的趨勢，且VRN1表達(dá)水平上調(diào)所需的時(shí)間與小麥品種不同類型所需的春化時(shí)間相一致，可能正是VRN1表達(dá)水平上調(diào)促進(jìn)了冬性品種發(fā)育進(jìn)程的加快，得以正常抽穗開花。而在春性品種中，VRN1在春化起始階段開始表達(dá)，隨著春化時(shí)間的延長波動上調(diào)。VER2基因在8個(gè)品種春化過程中的表達(dá)模式差異較大。春性品種中受到春化作用的誘導(dǎo)波動上調(diào)表達(dá)，而在冬性品種中，被春化作用所抑制波動