苧麻纖維發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序及expansin家族功能分析.pdf

1、苧麻(Boehmeria nivea L.Gaud)是蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬(Boehmeria)的多年生宿根性草本開花植物。苧麻主要采用傳統(tǒng)育種方法進(jìn)行育種，由于種植面積大幅萎縮、科研人員不足以及研究基礎(chǔ)薄弱等原因，其新品種的育種進(jìn)程一直比較緩慢，需要盡快引入分子育種手段加快其育種進(jìn)程。本研究對苧麻纖維發(fā)育進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和對expansin家族進(jìn)行了基因克隆和功能分析，主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.進(jìn)一步優(yōu)化了苧麻

2、不同樣品總RNA提取技術(shù)，并使用該基于異硫氰酸胍作為主要裂解成分的提取技術(shù)，成功從苧麻不同部位莖皮材料分別提取得到高質(zhì)量總RNA，以用于轉(zhuǎn)錄組測序。
　　轉(zhuǎn)錄組測序分別使用黑桿前期苧麻不同部位莖皮材料代表韌皮纖維不同發(fā)育時(shí)期，連接不同接頭之后使用羅氏454 FLX+平臺(tái)進(jìn)行混樣轉(zhuǎn)錄組測序，共得到1030057個(gè)reads，平均讀長457bp。對測序結(jié)果進(jìn)行拼接后，共得到58369條unigene，序列長度范圍為90bp到7641b

3、p，其中51025條（占87.42％）序列長度大于200bp，8025條（占13.75％）序列長度大于1000bp。最后，58369條unigene(13386條contig和44983條isotig)中有25071條unigene(7065條contig和18006條isotig)得到了有效的注釋，共對應(yīng)于6283條GO條目和3076條KO條目。
　　通過對差異性表達(dá)基因、GO條目富集情況等分析表明莖皮上部樣品在所有的樣品中更為

4、特殊，其所對應(yīng)的苧麻纖維發(fā)育早期可能更容易受分子調(diào)控影響，從而影響苧麻纖維發(fā)育狀況。在這之中，屬于纖維素合酶基因家族的isotig01514_77、isotig06919_78、isotig06943_25和isotig07154_19，屬于expansin基因家族的isotig10345_23、isotig01251_6和isotig02054_18，以及屬于XTH基因家族的HRX1MBH01BLWDW_9、 isotig00610_

5、25、 isotig01663_22、 isotig04660_8、isotig09773_10和contig04902_19在該樣品相對于其余三個(gè)樣品均為上調(diào)表達(dá)，表明這些基因可能參與苧麻莖皮上部樣品中針對纖維發(fā)育的相關(guān)調(diào)控路徑。
　　2.使用同源序列克隆的方法，獲得了五條苧麻expansin基因全長編碼序列，并對表達(dá)量進(jìn)行了初步研究?；诒緦?shí)驗(yàn)室的三個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序信息，克隆得到的expansin基因擴(kuò)充至16個(gè)（12個(gè)屬于α-亞

6、族，分別命名為BnEXPA1-BnEXPA12;4個(gè)屬于β-亞族，命名為BnEXPB1-BnEXPB4），共有22條（其中6個(gè)expansin基因在基因組中均有兩個(gè)序列相異的克隆，分別命名為-1和-2）全長DNA序列（GenBank登錄號:KY748166-KY748187）。序列分析表明，其外顯子長度跨度較小(107bp-485bp)而內(nèi)含子長度跨度較大(86bp-1540bp)，cDNA全長分布為732bp-831bp，而DNA全長

7、跨度為1040bp-4259bp。
　　在隨后對所克隆得到的expansin基因進(jìn)行表達(dá)分析中，BnEXPA2、BnEXPA3、BnEXPA5和BnEXPA6在六個(gè)樣品（莖尖、幼葉、成熟葉、莖皮上中下部）中的整體表達(dá)量和其它基因相比較高，BnEXPA12在這六個(gè)樣品中表達(dá)量差異性最大，BnEXPA3、BnEXPA5、BnXA10和BnEXPB2在苧麻三季麻（頭麻、二麻和三麻）不同時(shí)期（苗期、快速生長期、纖維成熟前期和后期）莖皮不同

8、部位（苗期下部莖皮、快速生長期上部和下部莖皮、纖維成熟期上部、中部和下部莖皮）樣品中的表達(dá)量和其它基因相比較高，BnEXPA11在上述所有樣品以及三種脅迫處理（氯化鈉、高溫和低溫脅迫）條件下表達(dá)量均極低。最后，BnEXPA1在不同脅迫條件下其表達(dá)量均顯著上升，也是所有苧麻expansin基因中唯一一個(gè)在三種脅迫條件下相對表達(dá)量均顯著上升的基因。與之相反，BnEXPA4、BnEXPA5、BnEXPA12、BnEXPB1和Bn EXPB3在

9、三種脅迫條件下其表達(dá)量均顯著下降。這些在表達(dá)量研究過程中呈現(xiàn)一定表達(dá)規(guī)律的基因都可作為候選基因在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中優(yōu)先得到進(jìn)一步的詳細(xì)研究。
　　綜上，本項(xiàng)研究主要亮點(diǎn)如下:
　　1.優(yōu)化了苧麻RNA提取技術(shù)，并用于轉(zhuǎn)錄組測序中;
　　2.轉(zhuǎn)錄組測序取樣方法為苧麻中首創(chuàng)，與纖維發(fā)育狀態(tài)對應(yīng);
　　3.首次對苧麻莖皮樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，研究纖維發(fā)育分子機(jī)理;
　　4.使用同源序列克隆方法得到五條苧麻expansin基