高溫脅迫下番茄Solexa轉(zhuǎn)錄組測序及LeCOR413-TM1基因克隆和功能分析.pdf

1、溫度脅迫是影響番茄作物產(chǎn)量及地域分布的主要限制因子之一，通過基因工程手段提高植物的抗性，培育耐高溫或耐低溫番茄品種是有效緩減溫度脅迫的重要途徑之一。
　　本實驗通過Solexa高通量測序，對高溫脅迫處理前后的番茄植株進行轉(zhuǎn)錄組測序，分析了受高溫脅迫上調(diào)和下調(diào)表達的基因，揭示了番茄高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組水平的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時，從Solexa測序下調(diào)的基因中篩選出一個番茄冷調(diào)節(jié)(Cold-regulated gene，COR)家族同源基

2、因，并從番茄品種中蔬6號葉片中分離到該基因，命名為LeCOR413-TM1，對其序列特征、表達模式以及轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆生理功能進行了研究。主要結(jié)果如下:
　　(1)高溫處理番茄植株，用Solexa技術(shù)進行序列測定，處理前后分別檢測到4661314和4981634個有信號的探針，各包含了186280和226513個特異性標(biāo)簽。去除假陽性標(biāo)簽后，分別獲得了4563284和4862014個清晰標(biāo)簽。通過比對番茄基因數(shù)據(jù)庫，分別找到了33

3、02958(72.38％)和3211809(66.06％)個匹配的標(biāo)簽。我們以log2值（變化倍數(shù)）＞2和＜-2、P-value值（統(tǒng)計學(xué)有效值）＜0.001、FDR（錯誤發(fā)生率）＜0.01作為篩選基因的標(biāo)準(zhǔn)，找到了284個上調(diào)基因和154個下調(diào)的基因，主要參與環(huán)境應(yīng)答的有36個上調(diào)和28個下調(diào)基因，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的有108個上調(diào)和36個下調(diào)基因，參與代謝的有53個上調(diào)和58個下調(diào)基因;其中未知基因約占18.9％。
　　(2)利用同

4、源序列設(shè)計引物，通過RT-PCR的方法從番茄葉片克隆到全長cDNA，命名為LeCOR413-TM1(AW034114)。該基因全長為726bp，開放閱讀框663bp，編碼221個氨基酸。qRT-PCR結(jié)果表明，LeCOR413-TM1在葉中表達量最高;同時，該基因的表達受4℃、PEG、ABA及強光誘導(dǎo)。
　　(3)將p35S-LeCOR413-TM1-GFP融合蛋白在煙草體中瞬時表達。通過Confocal觀察到GFP激發(fā)的綠色熒光

5、和葉綠素的紅色自發(fā)熒光完全重合，說明LeCOR413-TM1基因產(chǎn)物定位于葉綠體。
　　(4)將獲得的LeCOR413-TM1基因與含有35S啟動子的pBI121載體重組，構(gòu)建了正義過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，用PCR和qRT-PCR的方法對轉(zhuǎn)基因煙草植株進一步檢測，結(jié)果證明成功地獲得了轉(zhuǎn)正義的煙草植株。
　　(5)在低溫(4℃)脅迫條件下，與野生型相比較，轉(zhuǎn)基因煙草的種子萌發(fā)和幼苗的生長情況均好于野生型。這