玉米HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族抗旱相關基因的鑒定及ZnYihdzlo功能分析.pdf

1、玉米是世界上重要的糧食作物之一,干旱、鹽漬、低溫等非生物脅迫對玉米的生長造成了嚴重的影響,也是限制其產(chǎn)量的主要脅迫因素,抗逆育種一直是重要的育種目標。挖掘抗逆相關功能基因并利用這些基因培育抗逆新品種是應對逆境脅迫,提高玉米產(chǎn)量的最為有效途徑。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子在提高作物對脅迫的耐受性過程中起到了重要作用。過量表達特定的脅迫應答轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個下游抗逆功能基因的同時表達,從而使作物獲得良好的綜合改良效果。目前,這種方法已經(jīng)成為植物抗逆

2、遺傳改良育種中的研究熱點。同源異型-亮氨酸拉鏈(HD-Zip)蛋白是高等植物特異的一類轉(zhuǎn)錄因子,參與了植物的脅迫應答和生長發(fā)育調(diào)控。因此,挖掘脅迫應答HD-Zip基因?qū)﹂_展玉米抗逆改良育種具有重要的意義。本研究運用生物信息學的方法對玉米全基因組HD-Zip基因進行鑒定,分析這些基因的結構特點、進化關系以及干旱誘導表達模式,并通過過量表達技術對玉米Zmhdz10基因在植物非生物脅迫應答過程中的功能及作用機制進行了研究,獲得了如下主要結果:

3、
　　1.通過Blast同源搜索,共鑒定了55個非重復的玉米HD-Zip基因家族成員并從基因結構和進化等方面進行了分析。研究發(fā)現(xiàn),玉米HD-Zip家族的大部分基因序列高度保守,與擬南芥和水稻HD-Zip基因在結構上不存在明顯差異。根據(jù)進化關系,55個玉米HD-Zip基因被進一步分為4個亞族(I-IV)。染色體定位分析顯示,55個基因在10條染色體上的分布是非隨機的。對玉米HD-Zip基因復制事件進行分析,發(fā)現(xiàn)參與片段復制的基因占玉

4、米HD-Zip基因總數(shù)的62％,表明片段復制對玉米HD-Zip基因數(shù)量的擴張起到了重要作用。
　　2.對17個HD-ZipI基因上游2kb啟動子序列的抗逆相關順式作用元件(ABRE,LTRE和DRE)進行了分析,發(fā)現(xiàn)除Zmhdz16外,其余16個基因的啟動子區(qū)域均含有1到多個抗逆相關順式作用元件。對復制基因啟動子區(qū)域內(nèi)的3種順式作用元件的分布進行比較,發(fā)現(xiàn)三種順式作用元件在復制基因啟動子區(qū)域內(nèi)的數(shù)量和位置有較大的差異。利用熒光定量

5、PCR方法對HD-ZipI基因的干旱誘導表達模式進行了分析,發(fā)現(xiàn)有12個基因的表達顯著上調(diào),其它5個基因表達下調(diào)。對復制基因的干旱誘導表達模式進行比較,發(fā)現(xiàn)復制基因的表達模式總體較為相似,說明這些基因可能存在著基因功能的冗余現(xiàn)象。
　　3.根據(jù)進化關系和干旱誘導表達模式,篩選了一個受干旱強烈誘導表達的候選基因Zmhdz10并從玉米自交系B73中克隆了該基因。序列分析顯示,Zmhdz10基因cDNA全長為825bp,編碼274個氨基

6、酸,與玉米B73數(shù)據(jù)庫中公布的序列完全一致。進一步的表達分析發(fā)現(xiàn)Zmhdz10的表達還受到鹽和外源ABA的誘導。組織表達模式分析顯示,Zmhdz10在根、莖、葉、果穗、雄花序、幼芽和花絲7個組織中均有表達,其中在葉中的表達量最高。通過基因槍轟擊洋蔥表皮細胞的瞬時表達分析顯示,Zmhdz10-GFP融合表達蛋白定位在細胞核中。酵母雜交實驗表明,Zmhdz10在酵母細胞中能夠激活報告基因的表達,能夠?qū)Ψ聪蛑貜托蛄蠧AAT(A/T)ATTG發(fā)

7、生特異性的結合。
　　4.過量表達Zmhdz10的轉(zhuǎn)基因植株在生長表型上與對照植株沒有明顯差異。在干旱和鹽脅迫處理后,Zmhdz10轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出對脅迫較強的耐受性。通過對相對電解質(zhì)滲透率、丙二醛含量和脯氨酸含量等生理生化指標進行測定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在脅迫條件下的相對電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量低于野生型植株,脯氨酸含量高于野生型植株。另外,ABA敏感性實驗顯示Zmhdz10過量表達轉(zhuǎn)基因植株顯著提高了對外源ABA的敏感性。

8、　　5.Zmhdz10過量表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株同樣表現(xiàn)出對干旱和鹽脅迫較強的適應性和忍耐力。通過對P5CS1、RD22、RD29B和ABI14個脅迫/ABA應答功能基因的表達分析發(fā)現(xiàn),在干旱條件下,這些抗逆功能基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達量顯著高于野生型植株,表達被激活。對參與非依賴ABA信號傳導途徑的ERD1表達分析顯示,該基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達沒有顯著差異。
　　綜上所述,本研究通過Blast同源搜索,在玉米全基因組