陸棉抗旱相關(guān)基因(GhTrx、GhGR)克隆及其功能分析.pdf

1、干旱嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，20世紀(jì)80年代以來(lái)我國(guó)棉花旱情有加重的趨勢(shì)，每年應(yīng)旱災(zāi)減產(chǎn)的棉花總量達(dá)到30％以上。特別在棉花主產(chǎn)區(qū)新疆，干旱乃是限制其產(chǎn)量的主要因素。干旱對(duì)棉花產(chǎn)量的影響在各種非生物的環(huán)境脅迫因子中占首位，僅次于生物脅迫即病蟲害所造成的損失。干旱直接影響棉花正常代謝和生長(zhǎng)發(fā)育；干旱導(dǎo)致棉花細(xì)胞脫水，膜系統(tǒng)和酶系統(tǒng)遭到破壞，使細(xì)胞功能喪失，最終導(dǎo)致植株的代謝紊亂，進(jìn)而引起蛋白合成受阻，激素平衡破壞。因此，通過(guò)分子生物學(xué)手段

2、研究棉花抗旱基因及作用機(jī)制，從而提高棉花抗旱能力，培育抗旱品種已成為重要的課題。
　　 本研究以抗旱陸地棉材料中H177為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)抗旱抑制消減cDNA文庫(kù)(SSH)篩選到兩個(gè)抗旱相關(guān)基因的EST，利用RACE及RT-PCR技術(shù)克隆了2個(gè)陸地棉干旱脅迫相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng)，命名為GhTrx和GhGR。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)兩個(gè)基因做了抗旱相關(guān)性表達(dá)分析，并通過(guò)GFP對(duì)其基因亞細(xì)胞定位，擬南芥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因槍活體轉(zhuǎn)化

3、技術(shù)對(duì)2個(gè)基因功能做了進(jìn)一步研究分析。
　　 獲得陸地棉2個(gè)抗旱相關(guān)GhTrx和GhGR基因cDNA全長(zhǎng)序列。其中GhTrx基因cDNA全長(zhǎng)1340bp，它包括5’-UTR191bp，完整開放閱讀框864bp，3’-UTR285bp，編碼287個(gè)氨基酸殘基的多肽。GhGR基因cDNA全長(zhǎng)1035bp，它包括5’-UTR122bp，完整開放閱讀框792bp和3’-UTR121bp，編碼263個(gè)氨基酸殘基的多肽。
　　 生物

4、信息學(xué)分析表明，GhTrx基因編碼蛋白與楊樹、蓖麻、擬南芥的相似性分別為70％、72％和76％，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示GhTrx與蓖麻中該蛋白的親緣關(guān)系最近，同源結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明該基因有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該蛋白是由α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成。GhGR蛋白與氨基酸序列比對(duì)和同源性分析顯示該基因與楊樹、蓖麻、葡萄同源性最高，分別90％、91％和91％。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，GhGR與葡萄中該蛋白的親緣關(guān)系最近?？缒そY(jié)構(gòu)

5、域分析表明，該基因有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　 在抗旱材料中H177不同的組織和不同干旱處理時(shí)期材料，進(jìn)行Real-time PCR分析。結(jié)果表明，干旱脅迫下，GhTrx和GhGR基因在干旱材料的根、莖和葉中受到誘導(dǎo)表達(dá)，且在根和葉中2個(gè)基因的表達(dá)量高于莖中。由此可推測(cè)該基因在干旱脅迫時(shí)，根、莖和葉中能進(jìn)行大量表達(dá)以抵抗外界的干旱威脅，但根和葉部該基因的表達(dá)對(duì)應(yīng)對(duì)干旱逆境脅迫起著關(guān)鍵性的作用，有實(shí)驗(yàn)可知GhTrx和GhGR基因可能在

6、提高陸地棉抗旱性上發(fā)揮一定作用。
　　 構(gòu)建GFP-GhTrx和GFP-GhGR植物熒光表達(dá)載體，基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GhTrx蛋白定位于洋蔥的細(xì)胞膜上，GhGR蛋白可能定為在細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。
　　 構(gòu)建pBI121-GhTrx植物超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得轉(zhuǎn)GhTrx基因T3擬南芥種子，進(jìn)行抗旱性分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因的植株能提高擬南芥的抗旱性，由實(shí)驗(yàn)可知陸地棉的GhTrx基因的超量表達(dá)能提高擬南芥的