彩色棉類黃酮代謝相關(guān)基因GhANS和GhCHS基因的克隆與功能分析.pdf

1、棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，棉纖維是人類日常生活的必需品和紡織工業(yè)的重要原料之一。隨著人們環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)，彩色棉產(chǎn)品逐漸成為流行的趨勢(shì)與健康的新時(shí)尚。但是現(xiàn)存的天然彩色棉品種（系）還存在著一些問(wèn)題：一是產(chǎn)量低，品質(zhì)差，二是顏色單調(diào)、色牢度及色飽和度不足，色素遺傳不穩(wěn)定。這些問(wèn)題極大地限制了彩色棉產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用，因此，為了進(jìn)一步明確天然彩色棉纖維色素物質(zhì)的組成和沉積機(jī)理，闡明天然彩色棉纖維色澤形成的分子機(jī)理，對(duì)天然彩色棉的育種和

2、種質(zhì)創(chuàng)新顯得極為重要。多數(shù)研究認(rèn)為彩色棉纖維色素類物質(zhì)可能為類黃酮，為了明確彩色棉纖維中的色素類物質(zhì)成分，本研究從彩色棉纖維中克隆類黃酮生物合成途徑的兩個(gè)重要基因，并采用生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及亞細(xì)胞定位等方法系統(tǒng)地分析了它們的分子特征、表達(dá)特性和功能活性等。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以棕色棉及其白色近等基因系為材料，利用蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜分析，鑒定出其中一個(gè)差異表達(dá)蛋白為花色素合成酶（ANS）。以12DPA棕

3、色棉纖維細(xì)胞cDNA為模板，電子克隆獲得了編碼該蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列，序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因開放閱讀框?yàn)?062bp，編碼354個(gè)氨基酸，屬于花色素還原酶2-酮戊二酸加氧酶亞家族，將該基因命名為GhANS。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，GhANS基因在棉花中組成型表達(dá)，在纖維細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)時(shí)期該基因在棕色棉中表達(dá)量均高于其白色棉近等基因系，如在12DPA棕色纖維中的表達(dá)量相對(duì)值為0.26，比同時(shí)期白色纖維表達(dá)量高3倍以上，差異極顯著；

4、在27DPA棕色纖維中該基因仍有表達(dá)，而在白色纖維中幾乎檢測(cè)不到。以上結(jié)果表明GhANS基因可能在棕色棉纖維色素形成過(guò)程中發(fā)揮著一定作用。構(gòu)建GhANS基因GFP融合植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，熒光共聚焦顯微鏡觀察表明GhANS基因定位于細(xì)胞邊緣。⑵以棕色棉CHS基因的氨基酸序列（EU921263）為探針，在GenBank中與棉花EST序列進(jìn)行tBLASTn對(duì)比，選取同源性較高的EST序列使用軟件進(jìn)行拼接，獲得一個(gè)與查爾酮合成酶同源的cDNA

5、序列。以這個(gè)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以開花后3DPA的綠色棉纖維cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段連接到pGEMTeasy載體后進(jìn)行測(cè)序。序列分析表明，GhCHS基因cDNA全長(zhǎng)1524bp，包含1221bp的完整開放閱讀框，編碼407個(gè)氨基酸，具有明顯的polyA尾巴。GhCHS干擾基因cDNA全長(zhǎng)204bp，編碼68個(gè)氨基酸。⑶為進(jìn)一步研究GhANS與GhCHS基因的功能，分別構(gòu)建GhCHS基因的植物表達(dá)載體、GhCHS基因 R