苧麻轉(zhuǎn)抗旱基因的功能評(píng)估及抗旱轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、苧麻是中國(guó)重要的天然纖維作物之一，且被廣泛種植在印度和其他東南亞和環(huán)太平洋國(guó)家。苧麻的生物產(chǎn)量比較高，長(zhǎng)江流域一年可收獲三季，在雨水充足的菲律賓地區(qū)甚至可以收獲六季。由于研究起點(diǎn)較低、研究人員缺乏等原因，在GenBank中注冊(cè)的苧麻EST序列僅421條（截至2015年4月9日），且缺乏可參考的基因組圖譜信息。生物學(xué)信息的缺乏，嚴(yán)重阻礙了苧麻分子生物學(xué)的發(fā)展。本文利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，鑒定到了一些抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)建立的試管苗葉脈的遺

2、傳轉(zhuǎn)化體系。轉(zhuǎn)化了一個(gè)水稻干旱脅迫響應(yīng)的NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子SNAC1，進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子功能的驗(yàn)證。并且對(duì)抗旱材料進(jìn)行了組學(xué)研究。本文的主要結(jié)果如下:
　　1.采用“華苧5號(hào)”試管苗為實(shí)驗(yàn)材料，首次以試管苗葉脈為外植體建立一個(gè)高效的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苧麻遺傳轉(zhuǎn)化體系。然后測(cè)定了葉脈再生對(duì)卡那霉素的敏感性，篩選出葉脈遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中選擇培養(yǎng)時(shí)最佳卡那霉素濃度為40 mgL-1。
　　2.優(yōu)化了“華苧5號(hào)”葉脈遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中影響轉(zhuǎn)化的

3、一些因素:葉齡、農(nóng)桿菌濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌浸染時(shí)間以及共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮的濃度。得到產(chǎn)生最高遺傳轉(zhuǎn)化效率的具體條件為:以取自40 d試管苗苗齡的葉脈為外植體，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600值為0.6，菌液浸染時(shí)間為10min，共培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中乙酰丁香酮濃度為50 mg L-1，共培養(yǎng)時(shí)間為3d。以上條件能夠達(dá)到的平均轉(zhuǎn)化效率為23.25％。利用GUS和NPTⅡ基因的特異性引物進(jìn)行的PCR檢測(cè)、Southern雜交檢測(cè)、GUS染色組

4、織化學(xué)分析等進(jìn)一步證明了目的基因整合到苧麻基因組并在轉(zhuǎn)基因苧麻中得到表達(dá)。
　　3.利用已建立的苧麻葉脈遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化了一個(gè)水稻NAC(NAM，ATAFand CUC2)家族的SNAC1基因。對(duì)SNA C1基因不同轉(zhuǎn)基因家系進(jìn)行PCR檢測(cè)。隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)基因株系1，3，18和20做Southern拷貝數(shù)分析，檢測(cè)結(jié)果顯示SNAC1轉(zhuǎn)基因株系1，3和18為單拷貝的，轉(zhuǎn)基因株系20是雙拷貝的，隨機(jī)選擇轉(zhuǎn)基因株系3和20做后續(xù)的分析。熒

5、光定量結(jié)果表達(dá)分析證明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系3和20目的基因均過(guò)量表達(dá)。
　　4.對(duì)轉(zhuǎn)基因株系3和20三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期即苗期，旺長(zhǎng)期和纖維成熟期的植株做了抗逆性分析。苗期采用10％(w/v) PEG6000模擬干旱脅迫，對(duì)照組是培養(yǎng)在1/2的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中。苗期抗逆性分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系3和20在干旱脅迫處理?xiàng)l件下，鮮重和干重明顯的高于野生型。旺長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)材料的干旱脅迫方法采用飽和灌溉，然后去除多余的水，抑制澆水，進(jìn)而觀察植株的表型

6、。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旺長(zhǎng)期脅迫后，轉(zhuǎn)基因家系比野生型植株的凈光合速率、葉片相對(duì)含水量、脯氨酸、POD活性高，而丙二醛的含量則較低。干旱脅迫纖維成熟期的材料，其地上部分鮮重、鮮莖重、鮮皮重、干皮重，均比野生型植株高。綜上所述，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株具有較強(qiáng)的抗旱性。
　　5.本項(xiàng)研究中，對(duì)干旱脅迫的“華苧5號(hào)”利用15％(w/v) PEG6000進(jìn)行干旱脅迫。對(duì)處理(0h,12h,24h,48和72h)的葉片進(jìn)行葉片相對(duì)含水量、脯氨酸、

7、丙二醛和POD活性測(cè)定。根據(jù)這些生理指標(biāo)的變化規(guī)律分析，選擇干旱脅迫處理0h,24h和72h的葉片和根提取RNA。獲取cDNA集合，并利用Illumina配對(duì)末端測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，從而產(chǎn)生1.7億個(gè)原始測(cè)序讀長(zhǎng)。在經(jīng)PEG處理24h（L2和R2）和72h（L3和R3）的葉和根中共有16，798個(gè)基因差異性表達(dá)，其中，葉片中有9，281個(gè)，根中有8，627個(gè)。在這些基因中，來(lái)自AP2(3)、MYB(6)、NAC(9)、zinc