玉米抗旱miRNAs及其靶基因的發(fā)掘與功能驗證.pdf

1、MicroRNA(miRNA)是一類非編碼的內(nèi)源小RNA分子，在生物體的生命活動中起著重要的調(diào)控作用。miRNAs通過調(diào)控靶基因的表達來參與生物體的生長發(fā)育、分化增殖和細胞凋亡等生物學過程?，F(xiàn)在對于植物miRNA的研究仍然以擬南芥、水稻等模式植物為主，但是在其他一些植物中仍然有大量的物種特異的miRNA沒有被發(fā)現(xiàn)。玉米是全世界種植最廣泛的作物，同時也是重要的糧食作物之一，而干旱是限制玉米產(chǎn)量的主要因素之一，抗旱育種一直是研究者們重要的育

2、種目標，因此通過耐旱miRNA的鑒定來挖掘抗旱相關功能基因不僅有助于深入理解玉米抗旱機制，而且對培育玉米抗旱新品種提供有效途徑。本研究通過利用高通量測序技術鑒定兩個玉米自交系中差異表達顯著的新miRNAs，并對差異表達顯著的新miRNAs進行分析和靶基因的預測,在此基礎上利用轉(zhuǎn)基因方法過量表達miRNA的靶基因來進行功能鑒定和作用機制分析。獲得如下主要結(jié)果：
　　1、通過高通量測序技術總共鑒定了192個玉米miRNAs，包括124

3、個已知的miRNAs和68個新的miRNAs。68個新的miRNAs中有18個miRNAs的序列頻率極低并且長度超過24 nt，莖環(huán)引物熒光定量PCR反應結(jié)果顯示14個miRNAs在兩個玉米自交系中檢測到表達量。
　　2、對鑒定的192個玉米miRNAs進行篩選得到了29個在兩個玉米自交系中差異顯著性表達的miRNAs，包括18個下調(diào)miRNAs和11個上調(diào)miRNAs，其中有5個新的miRNAs：PC-3p-190, PC-3p

4、-104764, PC-3p-129630, PC-3p-552502和PC-5p-139812。對這5個新miRNAs進行靶基因的預測和GO注釋分析，發(fā)現(xiàn)預測的9個靶基因中，7個靶基因的GO注釋可以劃分為21個生物學過程，包括固碳作用、光合作用、蛋白水解作用等，而另外兩個靶基因沒有預測到任何生物學功能。此外，5個miRNAs中有4個miRNAs擁有共同的靶基因(GRMZM2G448344)， PC-3p-104764和 PC-3p-1

5、29630也擁有共同的靶基因(GRMZM2G360821 and GRMZM2G308907)，且這些靶基因都參與光合作用。
　　3、根據(jù)已公布的玉米18個組織的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對9個靶基因進行表達模式的分析，結(jié)果顯示9個靶基因具有不同的表達模式，但是都只在葉片中表達，其中GRMZM2G360821和 GRMZM2G308907的表達水平最高，說明這些靶基因可能在植物的光合作用中扮演著重要的角色，而這與上述靶基因的GO注釋

6、分析結(jié)果相一致。
　　4、通過Stem-loop RT-PCR方法檢測到ZmmiR139的表達量與其靶基因ZmDST44的表達量呈現(xiàn)負相關性，初步驗證ZmDST44是ZmmiR139的靶基因；然后利用5'RACE方法驗證ZmmiR139對ZmDST44的剪切作用，通過測序得到有41個測序結(jié)果正確且其剪切位點為同一位置。因此，通過Stem-loop RT-PCR及5’-RACE實驗驗證了ZmmiR139及其靶基因ZmDST44之間的

7、相互作用。
　　5、過量表達ZmDST44的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥在正常條件下的生長表型沒有明顯差異，而干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥相對于野生型具有明顯的抗旱表型；通過測定野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株在PEG6000處理下的萌發(fā)率和在干旱脅迫條件下的丙二醛含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在PEG6000處理下的萌發(fā)率顯著高于野生型植株，四個轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫條件下的丙二醛含量均顯著低于野生型植株，說明過量表達ZmDST44能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬

8、南芥的耐旱性。
　　6、過量表達ZmDST44的轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻在正常條件下的生長表型沒有明顯差異，而干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因水稻相對于野生型具有明顯的抗旱表型。此外，在干旱脅迫過程中，轉(zhuǎn)基因水稻的葉片相對含水量顯著高于野生型植株，表明過量表達ZmDST44可以提高植株在干旱脅迫條件下的保水能力。復水試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系的存活率顯著高于野生型株系。結(jié)合以上結(jié)果，說明過量表達ZmDST44基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱能力