水稻miRNAs靶基因驗證瞬時表達系統(tǒng)的構建及應用.pdf

1、MiRNAs是一類內源性非編碼小分子RNA，通過剪切靶基因mRNA或抑制蛋白的翻譯調控真核生物的基因表達。在植物體內，miRNAs主要參與了生長發(fā)育、逆境脅迫反應等多種生物進程。隨著測序技術的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了大量新的miRNAs，miRNA database已經(jīng)收錄了38589個miRNAs，然而大多數(shù)miRNA的生物功能及其靶基因仍需要進行進一步的驗證。研究miRNA的作用，關鍵是研究miRNA對靶基因的調控。MiRNAs靶基因的驗證

2、常用方法包括Northern Blot，Western Blot，降解組測序(Degradome sequencing)，MirTrap，RACE(Rapid amplification of cDNA ends)和熒光素酶報告系統(tǒng)。利用生物信息學預測miRNAs靶基因，采用不同的方法和不同的參數(shù)條件都可能會得到不同的靶基因，預測結果存在假陽性和假陰性，因此，對預測的靶基因進行實驗驗證也是必需的。鑒于miRNA靶基因的實驗驗證過程較為復

3、雜、耗時，因此，建立一種準確且快速地預測和驗證miRNA靶基因的方法對研究miRNA的生物學功能具有非常重要的意義。利用瞬時表達結合熒光素酶報告基因建立的檢測系統(tǒng)是靶基因驗證的一種快速、簡便的方法。本文利用農(nóng)桿菌所介導的煙草瞬時表達，結合水稻原生質體的瞬時表達，系統(tǒng)研究了不同體系下miRNAs的動態(tài)表達，以及靶基因驗證的最佳體系。主要結果如下:
　　(1)構建了適用于水稻原生質體瞬時表達的載體，將miR169o過表達載體分別與LU

4、C空白載體，靶基因LOC_Os03g48970.1與LUC的融合載體（后稱作LUC-48970）以及LUC-48970m3（及48970突變載體）共轉化到水稻原生質體中，miR169o和LUC-48970共轉化后的LUC活性顯著弱于miR169o和空白融合載體(LUC)共轉化，miR169o和LUC-48970m3（即48970的突變）共轉化后的LUC活性，表明miR169o可以抑制靶基因LOC_Os03g48970.1的轉錄表達，而水

5、稻原生質體系統(tǒng)可以用于miRNAs靶基因的檢測。
　　(2)在原生質體轉化后12h，18h，24h，36h分別檢測LUC活性，發(fā)現(xiàn)在24h時，LUC的活性最高，表明24h可能是最適宜觀察熒光的時期。此外，還利用qRT-PCR檢測了這四個時間點成熟miR169o的表達量，整體來看，miR169o的表達量與轉化時間具有正相關性，12h表達量最低，在24h表達量上調至十倍。當將miR169o與靶基因融合載體共轉化水稻原生質體后，在不同的

6、處理中miR169o的表達具有一定的差異。綜合miRNAs表達水平及LUC活性的檢測結果，建議在miRNAs靶基因的驗證中，水稻原生質體轉化后24h-36h作為后續(xù)最適宜的檢測時間。
　　(3)構建了適用于煙草瞬時表達的載體，將攜帶miR169o過表達載體與LUC空白載體，LUC-48970融合載體，LUC-48970m3載體的農(nóng)桿菌分別共注射到煙草葉片中，檢測LUC活性，發(fā)現(xiàn)miR169o與LUC-48970共表達中的LUC活性

7、明顯弱于miR169o與LUC共表達，miR169o與LUC-48970m3共表達中的LUC活性，表明煙草瞬時表達系統(tǒng)可以用于水稻mRNAs的靶基因驗證。注射煙草48h，72h，96h檢測LUC活性，發(fā)現(xiàn)72h LUC活性達到高峰后，又有所降低，表明72h是農(nóng)桿菌注射后最適宜的檢測點。此外，利用qRT-PCR檢測了注射后24h，36h，48h，72h成熟miR169o表達量，24h表達量最低，48h時表達量已顯著上調，且上調倍數(shù)達到近二

8、十倍。綜合這兩方面的檢測結果，建議在miRNAs靶基因驗證體系中，煙草注射菌后48h-72h作為后續(xù)最適宜的檢測時間。
　　(4)利用構建的水稻原生質體瞬時表達系統(tǒng)和煙草瞬時表達系統(tǒng)，檢測了miR812g與其預測靶基因LOC_Os02g07960.4和LOC_Os04g47140.1，miR5076與其預測靶基因LOC-Os02g27594.2，miR818a與其預測靶基因LOC_Os09g36320.1，miR169o與其預測靶