水稻除草劑抗性ALS基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因.pdf

1、在我國水稻是三大糧食作物之一，在國民生產(chǎn)中的地位舉足輕重。而在近十幾年來，水稻田中的雜草稻已成為了水稻生產(chǎn)過程中的一種新型草害。由于雜草稻的危害，造成水稻產(chǎn)量的損失每年高達(dá)上百萬噸。因此，發(fā)掘水稻抗性基因、培育抗除草劑水稻新品種成為了解決問題的最有效途徑。
　　本研究以水稻“選1”作為ALS基因克隆的材料，并且“選1”對咪唑乙煙酸——乙酰乳酸合酶(ALS)抑制劑類除草劑具有耐受性。由于ALS基因的一些特性:GC含量高、GC含量分布

2、極不均勻等特點(diǎn)，使得ALS基因難以克隆。研究主要通過對設(shè)計(jì)的不同引物、最適用的反應(yīng)酶、PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行了大量的摸索，不斷優(yōu)化條件，最終確定了完整的ALS基因的最為有效的克隆方法。
　　對獲得的完整的ALS基因，構(gòu)建了表達(dá)載體pCAMBIA1301-ALS，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105和Gv3101，以用來分別侵染浮萍的愈傷組織和野生型擬南芥。并且對農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的浮萍愈傷組織的侵染體系也進(jìn)行了部分條件的摸索，主要從暗

3、培養(yǎng)時間、暗培養(yǎng)培養(yǎng)基等方面進(jìn)行摸索。
　　本研究也對利用PCR介導(dǎo)的ALS基因的點(diǎn)突變進(jìn)行了摸索，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)了點(diǎn)突變位點(diǎn)1643位，旨在將TGG突變?yōu)門TG（Trp色氨酸變?yōu)長eu亮氨酸）。
　　與此同時，我們還以浮萍作為受試植物，建立的除草劑篩選系統(tǒng)。通過比較浮萍的形態(tài)結(jié)構(gòu)、葉狀體數(shù)、鮮重、葉綠素含量，篩選或定量地分析具有抑制植物生長作用或是以ALS為靶標(biāo)的多種除草劑。本實(shí)驗(yàn)對15種除草劑進(jìn)行了初篩以及有效作用濃度