靶向不同腫瘤基因的shRNA瞬時表達載體的構(gòu)建及聯(lián)合抗腫瘤活性的研究.pdf

1、癌癥的發(fā)生與多基因異常有關，包括癌基因的活化和抑癌基因的失活。RNA干擾被認為是一種非常有潛力的腫瘤治療手段，利用RNA干擾技術抑制癌基因的表達可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。但僅就一個基因為靶點往往只能部分逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型，治療效果有限。為尋求更加理想的抗腫瘤效果，可以在兩方面進行研究：第一是將RNA干擾技術聯(lián)合化療藥物，第二是利用RNA干擾技術靶向多個癌基因。本文就這兩方面進行了研究。 第一部分、靶向N—Ras的shRNA聯(lián)合長春

2、新堿的抗腫瘤活性研究。 一、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR的體外抗肝癌活性。 SRB法檢測pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對HepG2細胞的生長抑制。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR處理的細胞存活率為55.0％，1.5nMVCR的細胞存活率為77.24％，pCSH1—shNR與1.5nMVCR聯(lián)合處理的細胞存活率為34.60％，兩藥相互作用系數(shù)(CDI)為0.76；VCR濃度為2.5nM時的細胞生存率為46.18％，pCSH

3、1—shNR與2.5nMVCR聯(lián)合處理的細胞存活率為17.32％，CDI為0.64。結(jié)果說明轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR聯(lián)合長春新堿對HepG2細胞的生長有顯著協(xié)同抑制作用。 pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對HepG2細胞克隆形成能力的抑制。單獨轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR時，克隆形成率為50％，單獨VCR(2.5nM)處理時，克隆形成率為13.75％，pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合時，克隆形成率為6.67％，與單獨處理比較克隆形成抑

4、制率有明顯提高。 二、不同處理對增殖相關蛋白水平變化的影響。 不同處理對蛋白激酶ERK1/2及Akt活性的影響。轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR使HepG2細胞中的ERK1/2和Akt的磷酸化水平下降；VCR處理后，ERK1/2和Akt的磷酸化水平也下降；pCSH1—shNR聯(lián)合VCR組的ERK1/2和Akt的磷酸化水平下降幅度更大，說明pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合可以共同增強對Ras/Raf/MEK/ERK1/2和Ras/

5、PI3K/Akt通路的阻遏作用。 細胞核因子NF—κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其過表達和活化與癌癥的發(fā)生相關。ERK1/2及Akt都參與對NF—κB的調(diào)節(jié)。在人多發(fā)性骨髓瘤細胞中，NF—κB的下調(diào)可以誘導細胞對VCR的化療敏感性。我們檢測了不同處理對NF—κB通路的影響，結(jié)果顯示pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理組的NF—κB信號通路的活性被整體下調(diào)，并且被抑制的程度大于其它處理組。 表皮生長因子受體(EGFR)參與R

6、as信號通路的活性調(diào)節(jié)及細胞對VCR作用的響應，在HepG2中表達組成型的磷酸化EGFR。Western Blot檢測pCSH1—shNR及VCR處理對EGFR表達及活性的影響，結(jié)果顯示pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理協(xié)同下調(diào)了EGFR的表達，N—Ras的表達抑制減弱了細胞響應VCR處理時對EGFR的活化。 三、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對HepG2細胞周期分布的影響。 流式細胞儀檢測pCSH1—shNR聯(lián)合VC

7、R對HepG2細胞周期分布的影響。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR處理對HepG2細胞周期分布的影響不是很明顯。用VCR(1.5nM和2.5nM)處理細胞后，低劑量VCR可以引起S期阻滯，高劑量VCR可以引起G2/M期阻滯，結(jié)果說明VCR引起的細胞周期阻滯是劑量依賴性的。pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理，結(jié)果顯示pCSH1—shNR可以降低VCR引起的S期或G2/M期阻滯。 Western blot檢測細胞周期蛋白(Cycli

8、n)和依賴細胞周期蛋白的蛋白激酶(Cdk)的變化。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR、VCR、pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理都下調(diào)了cyclinD1、Cdk2、Cdk4和Cdk6的表達，與單獨處理比較聯(lián)合處理的下調(diào)作用顯著提高。此外，pCSH1—shNR可以逆轉(zhuǎn)VCR引起的cyclin E和cyclin Bl的上調(diào)作用，VCR抑制pCSH1—shNR對Cdc2的上調(diào)作用。因此pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理使Cyclins和Cdk

9、s的整體活性水平趨于下降。 Western blot檢測Rb磷酸化和E2F—1的表達水平。結(jié)果顯示pCSH1—shNR使Rb磷酸化水平略有下調(diào)，E2F—1表達略有下降；VCR使Rb磷酸化水平大幅提高，E2F—1表達略有下降；pCSH1—shNR聯(lián)合VCR使Rb磷酸化水平顯著高于對照組，但也顯著低于VCR組，聯(lián)合組的E2F—1表達下降最多。結(jié)果說明pCSH1—shNR抑制了VCR刺激Rb磷酸化的作用，促進了對E2F—1表達的下調(diào)作

10、用。 四、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對HepG2細胞凋亡的誘導作用。 流式細胞儀檢測pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對HepG2細胞的凋亡誘導作用。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR的凋亡誘導率為6.07％，VCR的凋亡誘導率為12.29％，而pCSH1—shNR聯(lián)合VCR的凋亡誘導率為22.82％，說明pCSH1—shNR聯(lián)合VCR協(xié)同誘導HepG2細胞凋亡。 Westernblot檢測結(jié)果顯示，pCSH1—sh

11、NR聯(lián)合VCR協(xié)同誘導HepG2細胞凋亡與Bax無關，但pCSH1—shNR顯著下調(diào)凋亡抑制蛋白Survivin的表達量，從而抑制VCR對Survivin的上調(diào)，降低了Survivin對凋亡的抑制作用，進一步增強了VCR對HepG2細胞的凋亡誘導作用。 五、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR誘導細胞衰老的作用。 采用SA-β—gal染色法檢測轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR聯(lián)合VCR誘導HepG2細胞衰老的作用。結(jié)果顯示，pCSH1

12、—shNR的細胞衰老誘導率為11.32％，VCR(2.5nm)的細胞衰老誘導率為8.23％；pCSH1—shNR聯(lián)合VCR的細胞衰老誘導率為18.76％。結(jié)果說明pCSH1—shNR聯(lián)合VCR誘導細胞衰老的能力更強。 六、pCSH1—shNR對VCR誘導MDR1基因表達的影響。 腫瘤細胞對VCR的抗性與MDR1基因表達產(chǎn)物P—糖蛋白(P—gp)的過表達有關，而ras癌基因可以調(diào)控MDR1基因的表達。WesternBlot

13、檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR后進行VCR處理的HepG2細胞內(nèi)P—gp的升高幅度明顯小于VCR處理組。 綜上所述，pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理對HepG2細胞的生長產(chǎn)生了顯著的抑制效果，細胞凋亡率增多，細胞表面的EGFR的表達和活性都降低，細胞內(nèi)的ERK1/2和Akt的活性被協(xié)同抑制，Cyclin和Cdk的整體活性水平趨于下降，轉(zhuǎn)錄因子E2F—1和NF—κB的表達和活性被下調(diào)，pCSH1—shNR抑制了VCR

14、引起的Survivin和MDR1基因表達上調(diào)。本研究結(jié)果提示，靶向特異基因的RNA干擾技術與化療藥物聯(lián)合應用于肝癌治療具有好的療效。 第二部分、MDM2和Pin1的shRNA表達載體構(gòu)建及其抗腫瘤活性。 一、靶向MDM2和Pin1的shRNA表達載體的構(gòu)建。 采用本室已證明可以有效抑制MDM2表達的RNA干擾序列，以及文獻報道中已證明可以有效抑制Pin1表達的RNA干擾序列，將這兩段序列構(gòu)建到已有的多基因shRN

15、A表達載體pCSH1—1中，新構(gòu)建的載體命名為pCSH1—shPM。 二、pCSH1—shPM對靶蛋白表達的影響。 實驗選擇人的成纖維肉瘤HT1080細胞進行研究。Westernblot檢測顯示，轉(zhuǎn)染pCSH1—shMDM2可以下調(diào)MDM2的表達，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPin1可以降低Pin1的表達，也可以使得MDM2的表達有所下降。轉(zhuǎn)染pCSH1—shPM可以同時有效降低MDM2和Pin1的表達，對MDM2的下調(diào)程度略大

16、于轉(zhuǎn)染pCSH1—shMDM2組，說明抑制Pin1的表達可能下調(diào)MDM2的表達。進一步實驗證明，在低表達Pin1的HT1080-shPin1穩(wěn)定細胞系中，MDM2的表達量明顯低于對照組，說明在HT1080細胞中抑制Pin1的表達確實可以下調(diào)MDM2的表達。 三、pCSH1—shPM對細胞生長的影響。 SRB法檢測不同處理對細胞生長的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPin1和pCSH1—shMDM2都對HT1080細胞

17、的生長有抑制作用，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPM對細胞生長的抑制作用強于pCSH1—shPin1或pCSH1—shMDM2單獨處理，說明同時抑制MDM2和Pin1的表達更有效地抑制了HT1080細胞的生長。 四、pCSH1—shPM對細胞運動能力的影響。 采用劃痕實驗檢測不同處理對細胞運動能力的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPin1、pCSH1—shMDM2和pCSH1—shPM都能夠減弱HT1080細胞的運動能力，各個