新型腫瘤基因疫苗載體的構(gòu)建及其抑瘤活性的初步研究.pdf

1、DNA疫苗有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如與重組蛋白或全腫瘤細(xì)胞疫苗相比，DNA疫苗易于操作的特點(diǎn)使它更易于大規(guī)模的生產(chǎn)；可同時(shí)編碼多個(gè)免疫調(diào)節(jié)分子等。DNA疫苗的安全性在動(dòng)物模型及人類臨床試驗(yàn)中也得到了證實(shí)。更重要的是，機(jī)體很少出現(xiàn)中和質(zhì)粒DNA的免疫應(yīng)答，因此，DNA疫苗可以多次重復(fù)給藥。DNA疫苗對(duì)腫瘤及感染性疾病的預(yù)防及治療性作用在動(dòng)物模型中已經(jīng)得到了證實(shí)，直接接種編碼腫瘤相關(guān)抗原的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的CT

2、L細(xì)胞及抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用能抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　然而，DNA疫苗應(yīng)用于人體時(shí)還面臨著許多困難，臨床試驗(yàn)的結(jié)果總是不盡如人意。其中的原因之一是CD4+T細(xì)胞不能有效的活化。免疫的DNA質(zhì)粒進(jìn)入機(jī)體后，所表達(dá)的內(nèi)源性抗原將通過(guò)MHCI類加工途徑遞呈給CD8+T細(xì)胞。而CD4+T細(xì)胞的活化對(duì)基因疫苗起著至關(guān)重要的作用：抗體類別轉(zhuǎn)換，特異性B細(xì)胞、T細(xì)胞擴(kuò)增，記憶細(xì)胞的形成及機(jī)體其他免疫功能發(fā)揮都需要活化的CD4+T細(xì)胞提供共刺激分子及

3、細(xì)胞因子。因此，將抗原分子直接帶入MHCII類提呈途徑（如內(nèi)體、溶酶體）將使抗原由內(nèi)源性加工提呈途徑向外源性加工提呈途徑轉(zhuǎn)化，有效活化CD4+T細(xì)胞，促進(jìn)其提供共刺激分子及細(xì)胞因子。溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosome associated membrane protein,LAMP）屬I型穿膜蛋白，主要定位于溶酶體外膜。新合成的LAMP分子通過(guò)C末端短胞漿尾中的識(shí)別序列YXX?（?代表任意一親水性氨基酸）能特異性的靶向輸從細(xì)胞漿送至內(nèi)體

4、/溶酶體。
　　人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）及Survivin是兩個(gè)腫瘤相關(guān)抗原，在結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌等大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在相應(yīng)的正常組織中基本不表達(dá)。hCG及Survivin高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥性密切相關(guān)。因此，基于這兩種分子的各種疫苗用于相應(yīng)腫瘤的免疫治療。CTP37-DT是由β-hCG的C末端37個(gè)氨基酸與白喉類毒素（DT）相連制

5、備的亞單位疫苗。最近，CTP37-DT作為治療結(jié)腸癌的藥物已經(jīng)通過(guò)I期及Ⅱ期臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)證實(shí)該疫苗是安全的并且能延長(zhǎng)進(jìn)展期結(jié)腸癌患者的生存期。而關(guān)于Survivin的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，機(jī)體能產(chǎn)生針對(duì)Survivin多肽的特異性殺傷性T細(xì)胞，例如在乳腺癌、白血病及黑色素瘤患者體內(nèi)都能檢測(cè)到Survivin多肽特異性的MHC-I類分子限制的效應(yīng)性T細(xì)胞。迄今為止，已經(jīng)確定了多個(gè)由HLA-A*0201或HLA-A*0301限制遞呈的表位

6、，這些表位被用作特異性CTL應(yīng)答的靶標(biāo)。
　　大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，新生血管的形成促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。VEGF及其受體（尤其是vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2，VEGFR2）在生理性及病理性血管形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。VEGF及其受體在腫瘤組織中常常高表達(dá)，針對(duì)二者的抗體、免疫毒素、核酶、可溶性受體及小分子酪氨酸激酶抑制劑等在動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)中取得了良好的治療效果。因此，VEGFR

7、2是治療腫瘤的又一理想靶標(biāo)。VEGFR2的胞膜外區(qū)含有7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。第三個(gè)結(jié)構(gòu)域在最小的配受體結(jié)合單位中至關(guān)重要,將其移除后將導(dǎo)致配受體結(jié)合功能的完全喪失；第四結(jié)構(gòu)域在維持配受體的高結(jié)合力上起主要作用，刪除第四結(jié)構(gòu)域?qū)?dǎo)致結(jié)合率的驟減。
　　因此，我們將編碼β-hCGC末端37個(gè)氨基酸、Survivin的5個(gè)不同HLA限制性的CTL表位及VEGFR2包膜外區(qū)第三、第四結(jié)構(gòu)域氨基酸的堿基拼接起來(lái)作為編碼腫瘤復(fù)合抗原基因（H

8、SV）并插入LAMP分子溶酶體內(nèi)腔與穿膜區(qū)之間，構(gòu)建DNA疫苗p-L/HSV，希望能通過(guò)LAMP分子的作用將腫瘤抗原靶向到MHC-II類提呈途徑。
　　用p-L/HSV及各組對(duì)照質(zhì)粒免疫小鼠，共免疫三次，最后一次免疫后三周行ELISPOT及殺傷試驗(yàn)。ELISPOT數(shù)據(jù)提示，在腫瘤復(fù)合抗原人工合成的重疊肽（18aa/肽，重疊8aa）中，11、18、22、24號(hào)肽可刺激p-L/HSV組T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，且特異性T細(xì)胞數(shù)目明顯高于相

9、應(yīng)對(duì)照組p-HSV（P＜0.05）；當(dāng)4、8、9號(hào)肽刺激時(shí)，p-L/HS組IFN-γ的分泌量顯著高于p-HS組；p-L/V組可產(chǎn)生19、24號(hào)肽特異性T細(xì)胞分泌IFN-γ；相對(duì)于p-L/V組，p-L/HSV組產(chǎn)生更強(qiáng)的24號(hào)肽特異性免疫應(yīng)答。殺傷試驗(yàn)中，當(dāng)效靶比為50:l時(shí)，以1-4號(hào)混合肽加載P815細(xì)胞作為靶細(xì)胞，p-L/HSV組的殺傷率約為p-HSV組的4倍；p-L/HS組對(duì)加載1-4號(hào)混合肽的P815細(xì)胞的殺傷率顯著高于p-HS

10、組（P＜0.05）；p-L/V組的特異性殺傷見于23-26號(hào)混合肽加載的P815細(xì)胞；當(dāng)靶細(xì)胞為1-4號(hào)混合肽加載的P815細(xì)胞時(shí)，p-L/HSV組脾細(xì)胞的殺傷率亦顯著高于p-L/HS組。間接ELISA結(jié)果顯示，p-L/HSV組能產(chǎn)生針對(duì)1-4，10-14，15-18，23-26號(hào)混合肽的特異性抗體，且隨著免疫次數(shù)的增加，抗體濃度逐漸增加，至第三次后達(dá)到最高值；p-L/HS組產(chǎn)生的針對(duì)hCG及Survivin的特異性抗體濃度（1-9號(hào)肽