多靶點(diǎn)抗腫瘤天然活性成分篩選及其抑瘤活性研究.pdf

1、本論文重點(diǎn)圍繞多靶點(diǎn)抗腫瘤天然活性成分的篩選及抗腫瘤機(jī)制開(kāi)展研究，構(gòu)建EGFR、TNFR、Fas多靶點(diǎn)脂筏色譜模型，提取北葶藶子中具有抗腫瘤活性的部位。研究抗腫瘤活性部位體外抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞株增殖、促進(jìn)凋亡、調(diào)控周期及抑制遷移的機(jī)理。分析北葶藶子抗腫瘤活性部位體內(nèi)的急性毒性，同時(shí)探討其體內(nèi)抑制乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的機(jī)理。主要分為以下五個(gè)部分:
　　第一章多靶點(diǎn)脂筏親和色譜概述及中藥抗腫瘤概述
　　對(duì)脂筏親和

2、色譜的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，充分調(diào)研了脂筏親和色譜的研究現(xiàn)狀，闡述了多靶點(diǎn)脂筏親和色譜的構(gòu)建原理;分別基于中醫(yī)傳統(tǒng)理論及現(xiàn)代分子生物學(xué)角度對(duì)中藥抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了綜述。同時(shí)，闡述了本文研究對(duì)象，即北葶藶子的研究現(xiàn)狀，提出了本論文的研究目的、研究展望及實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)，為論文實(shí)驗(yàn)工作的順利進(jìn)行奠定了理論基礎(chǔ)。
　　第二章多靶點(diǎn)脂筏色譜的構(gòu)建及北葶藶子抗腫瘤活性部位的篩選
　　構(gòu)建了富含表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子受體(

3、TNFR)和凋亡相關(guān)蛋白因子(Fas)的新型多靶點(diǎn)脂筏色譜，為實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)、快速、在線篩選中藥抗腫瘤活性成分奠定了基礎(chǔ)。將多靶點(diǎn)脂筏色譜技術(shù)應(yīng)用于北葶藶子各部位抗腫瘤活性的篩選，采用MTT法對(duì)北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位進(jìn)行抗腫瘤活性研究。
　　從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株提取富含EGFR、TNFR、Fas的脂筏，制備硅膠固定相并與脂筏連接，構(gòu)建多靶點(diǎn)脂筏色譜。制備CdTe量子點(diǎn)并與EGFR、TNFR和Fas一抗偶聯(lián)后對(duì)脂筏色譜進(jìn)行鑒

4、定。采用多靶點(diǎn)脂筏色譜篩選北葶藶子的水提液、乙醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水飽和正丁醇萃取部位及萃余部分的抗腫瘤活性部位。該活性部位以0.05μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL分別作用于人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人肝癌細(xì)胞株HepG-2、人胃癌細(xì)胞株SGC和小細(xì)胞肺癌SCLC細(xì)胞株，72h后MTT法檢測(cè)其對(duì)四種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。此外，該活性部位及5-Fu分別以濃度1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25

5、μg/mL、50μg/mL作用于大鼠成纖維細(xì)胞，MTT法考察該活性部位及5-Fu對(duì)大鼠成纖維細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明:北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位7.02～18.66 min在多靶點(diǎn)脂筏色譜柱上有保留行為，表明該部位具有抗腫瘤活性。MTT法檢測(cè)水飽和正丁醇萃取部位對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抑制效果（IC50為0.77μg/mL）優(yōu)于HepG2（IC50為1.55μg/mL）、SGC（IC50為5.49μg/mL）和SCLC（IC50為6.09μg

6、/mL）細(xì)胞株。水飽和正丁醇萃取部位對(duì)大鼠成纖維細(xì)胞的毒性較小。
　　第三章北葶藶子活性部位抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株機(jī)制的研究
　　從抑制增殖、促進(jìn)凋亡、調(diào)控周期、抑制遷移四個(gè)方面對(duì)北葶藶子活性部位的體外抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)全面的研究。Western blot及免疫熒光法檢測(cè)了增殖相關(guān)的ERK磷酸化活性、凋亡相關(guān)的Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)、細(xì)胞周期蛋白PCNA的表達(dá);采用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)MCF-7細(xì)胞株的早期凋亡和周期

7、進(jìn)行了分析;采用DNA Ladder和transwell技術(shù)研究了MCF-7細(xì)胞株的凋亡及其遷移。
　　Western blot及免疫熒光法檢測(cè)了北葶藶子活性部位對(duì)ERK磷酸化活性的作用，結(jié)果表明:其明顯抑制了ERK磷酸化的活性，且隨濃度的增加，抑制作用明顯增強(qiáng)。由此推測(cè)，北葶藶子活性部位對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抑制增殖作用是通過(guò)抑制ERK介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。
　　通過(guò)Western blot檢測(cè)了北葶藶子活性部位對(duì)

8、Bcl-2和Bax蛋白的作用，結(jié)果表明:北葶藶子活性部位作用于MCF-7細(xì)胞株24h后，對(duì)Bcl-2表達(dá)的抑制作用和對(duì)Bax表達(dá)的促進(jìn)作用均呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，說(shuō)明其在24h時(shí)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞株凋亡是通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。AnnexinⅤ/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡發(fā)現(xiàn)，北葶藶子活性部位可以明顯增加MCF-7細(xì)胞株的早期凋亡，且具有時(shí)間劑量依賴(lài)關(guān)系。DNA Ladder研究北葶藶子活性部位及5-Fu對(duì)MCF-7細(xì)胞株凋亡的

9、作用，結(jié)果表明:活性部位及5-Fu作用72h后，低、中、高三個(gè)濃度均可看到明顯的梯形條帶。
　　流式細(xì)胞技術(shù)分析北葶藶子活性部位對(duì)MCF-7細(xì)胞株周期影響的結(jié)果顯示，空白對(duì)照組S期細(xì)胞所占比例較高，提示MCF-7細(xì)胞株DNA合成活躍，腫瘤增殖性強(qiáng)。北葶藶子活性部位高濃度使MCF-7細(xì)胞株G0/G1期細(xì)胞的比例明顯增加，而S期MCF-7細(xì)胞所占的比例明顯下降，且有劑量依賴(lài)關(guān)系，表明其將MCF-7細(xì)胞株阻滯于G0/G1期，造成了G1期

10、細(xì)胞堆積阻滯。Western blot及免疫熒光法分析PCNA蛋白的表達(dá)，北葶藶子活性部位的低濃度給藥組在不同時(shí)間點(diǎn)均對(duì)PCNA的表達(dá)無(wú)明顯抑制作用，而中、高濃度組則能明顯抑制PCNA的表達(dá)，從而干擾MCF-7細(xì)胞S期DNA的合成，降低了S期細(xì)胞所占比例。
　　采用transwell法檢測(cè)了北葶藶子活性部位及5-Fu對(duì)MCF-7細(xì)胞株遷移的作用。結(jié)果表明:北葶藶子活性部位組及5-Fu組均能明顯抑制MCF-7細(xì)胞株的遷移，且均呈時(shí)間

11、劑量依賴(lài)關(guān)系。相同濃度的北葶藶子活性部位組與5-Fu組兩者對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用無(wú)明顯差異。
　　第四章北葶藶子活性部位急性毒理學(xué)研究
　　采用急性毒性分類(lèi)法、改良寇氏法評(píng)價(jià)北葶藶子活性部位經(jīng)口、經(jīng)腹腔急性毒性作用。計(jì)算了北葶藶子活性部位經(jīng)口/腹腔的LD50，為其裸鼠移植瘤抑制作用的研究提供了劑量依據(jù);通過(guò)計(jì)算北葶藶子活性部位經(jīng)口/腹腔的臟器系數(shù)，評(píng)價(jià)其急性毒性。
　　急性毒性分類(lèi)法結(jié)果表明:北葶藶子活性部位按2000

12、mg/kg的劑量對(duì)小鼠灌胃給藥的LD50約為4000～5000mg/kg，為低毒物質(zhì)。改良寇氏法計(jì)算腹腔注射給藥的LD50，結(jié)果顯示:小鼠腹腔注射給藥的LD50為505.36 mg/kg，LD50的95％平均可信限為590.32 mg/kg～432.61 mg/kg。北葶藶子活性部位腹腔注射劑量低于250mg/kg時(shí)，無(wú)急性毒性，為低毒物質(zhì)。
　　第五章北葶藶子活性部位對(duì)裸鼠MCF-7移植瘤抑制作用的研究
　　構(gòu)建了人乳腺癌

13、MCF-7細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型，對(duì)北葶藶子活性部位經(jīng)口、經(jīng)腹腔的體內(nèi)抑瘤活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采用Western blot檢測(cè)了Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，對(duì)北葶藶子活性部位的體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　裸鼠背部右側(cè)皮下接種MCF-7細(xì)胞株建立移植瘤模型，北葶藶子活性部位按100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg口服給藥;按25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg腹腔注射給藥;5-Fu腹腔注射給

14、藥20 mg/kg，治療4周。治療結(jié)束后剝離瘤塊，測(cè)量瘤塊體積并稱(chēng)重。采用Western blot對(duì)Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明:北葶藶子活性部位經(jīng)口服給藥、腹腔注射給藥及5-Fu對(duì)瘤塊體積和重量均有明顯抑制作用(P＜0.05)。Western blot檢測(cè)北葶藶子活性部位組及5-Fu組均明顯降低了Bcl-2蛋白的表達(dá)，增加了Bax蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。北葶藶子活性部位腹腔注射給藥組對(duì)Bcl-2的抑制作用有劑量依