金針菇抗腫瘤活性成分篩選及其納米制劑研究.pdf

1、金針菇是一種深受人們喜愛的食用菌，富含糖類、蛋白質(zhì)、膳食纖維和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。近些年來，已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報道從金針菇中分離得到的蛋白質(zhì)和多糖具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和保護(hù)肝臟等多種多樣的活性功能。除此之外，黃酮、萜類、脂肪酸、甾醇以及核苷等小分子物質(zhì)也被從中發(fā)現(xiàn)。目前關(guān)于這些小分子物質(zhì)的生物活性報道主要集中在抗菌、抗氧化方面。
　　 麥角甾醇是金針菇所含甾醇類成分的主要成分之一，具有確切的抗腫瘤效果。然而，作為一種植物甾醇，

2、麥角甾醇極難溶于水，在體內(nèi)的吸收率很低。
　　 粗脂肪約占金針菇干重的9％，主要是指脂肪酸和甾醇。目前從金針菇脂質(zhì)類物質(zhì)中篩選出抗腫瘤活性成分，并研究提高生物利用度的工作還未見報道。
　　 腫瘤是現(xiàn)今危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，世界各國的專家學(xué)者都在積極研究尋找治療腫瘤的方法和藥物。本文通過一種新型酪氨酸激酶受體抑制劑的高通量篩選模型--脂筏色譜，首次從金針菇中篩選出具有抗腫瘤活性的物質(zhì)群--石油醚萃取物和乙醚萃取物。

3、進(jìn)一步研究表明，該物質(zhì)群主要由脂肪酸和甾醇組成。體外腫瘤細(xì)胞抑制增殖實驗證明二者具有良好的抑瘤活性。然而甾醇的水溶性很差，有必要改善其溶解度和生物利用度。納米給藥系統(tǒng)是提高難溶性藥物溶解度和生物利用度的有效途徑之一，本文制備了三種金針菇甾醇納米制劑，通過不同給藥途徑，對納米制劑在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)、小鼠體內(nèi)的組織分布進(jìn)行了初步研究。研究結(jié)果顯示，納米制劑能夠提高甾醇的溶解度和生物利用度。上述研究結(jié)果為甾醇的新藥開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。全文

4、主要研究工作如下：
　　 1、根據(jù)酪氨酸激酶受體抑制劑的高通量篩選模型--脂筏色譜，我們發(fā)現(xiàn)金針菇中甾醇和脂肪酸提取物具有抗腫瘤活性。采用MTT法測定兩種提取物對體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、胃腺癌細(xì)胞SGC、肺腺癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞HeLa、結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo增殖的抑制作用。應(yīng)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析兩種提取物的化學(xué)成分，利用高效液相色譜法(HPLC)分離制備甾醇物中的含量較高的兩個主要

5、成分，并鑒定它們的化合物結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果顯示：金針菇甾醇和脂肪酸提取物對HepG2、SGC、U251、A549四種腫瘤細(xì)胞有較強的抑制作用，甾醇體外抑制HepG2、SGC、U251和A549增殖的IC50為9.29、11.99、23.85和20.44μg·mL-1，脂肪酸體外抑制SGC增殖的IC50為69.91μg·mL-1，對HeLa、Lovo二種腫瘤細(xì)胞抑制作用較弱。甾醇提取物含有麥角甾醇，22，23-二氫麥角甾醇，Ergosta-5

6、，8，22-triene-3-ol以及Ergost-8(14)-ene-3β-ol等四種成分；脂肪酸提取物含有19種成分，主要是十六烷酸，9-十八碳烯酸，9，12-十八碳二烯酸，9，12，15-十八碳三烯酸。
　　 2、首次建立起RP-HPLC法同時測定金針菇子實體中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量。色譜柱為Inertsil ODS-SP(250 mm×4.6mm，5μm)，流動相為98％甲醇，流速1.0 mL·min-

7、1，檢測波長282 nm。麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇在0.582～72.768μg·ml-1和0.586～73.248μg·ml-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)測定，烘干后的金針菇子實體中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的含量為0.30％和0.072％。
　　 3、為了改善金針菇甾醇的水溶性，我們運用納米技術(shù)制備了金針菇甾醇微乳、脂質(zhì)體和納米膠束三種納米制劑，并對其基本性質(zhì)進(jìn)行了考察。微乳為水包油型，平均粒徑為22.9

8、nm，多分散性指數(shù)為0.310，包封率為(81.1±1.2)％。脂質(zhì)體的平均粒徑為108 nm，多分散性指數(shù)為0.151，包封率為(71.3±0.1)％。納米膠束的平均粒徑為115.6 nm，多分散性指數(shù)為0.029，包封率為(76.6±0.2)％。所制備的三種納米制劑粒徑小，包封率較高。
　　 4、首次建立起HPLC法同時測定鼠血漿樣品、組織樣品和糞便樣品中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇兩種物質(zhì)含量的體內(nèi)分析方法，并對定量

9、分析方法進(jìn)行了驗證。色譜柱為Inertsil ODS-SP(250 mm×4.6 mm×5μm)，血漿、心、肝、脾、肺、腎、腦和糞便樣品的流動相為96％甲醇溶液，胃樣品的流動相為93％甲醇溶液，流速1.0mL·min-1，紫外檢測波長282 nm，檢測靈敏渡0.02 AUFS。所建立的分析方法專屬性強，回收率、精密度以及冷凍穩(wěn)定性等指標(biāo)符合體內(nèi)藥物分析要求。
　　 5、以金針菇甾醇原藥為對照，通過不同給藥途徑分別給予大鼠三種金針

10、菇甾醇納米制劑，同時測定麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇在血漿中的濃度，研究金針菇甾醇納米制劑在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)。(1)相比金針菇甾醇原藥，口服給藥后，微乳組、脂質(zhì)體組和納米膠束組中麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇的AUC0-24分別提高了2.6、1.6和1.5倍，以及4.5、2.5和2.8倍。(2)相比金針菇甾醇原藥，腹腔注射后，微乳組、脂質(zhì)體組和納米膠束組中麥角甾醇的AUC0-24提高了47.5、4.3和8.4倍，22，23

11、-二氫麥角甾醇的AUC0-24分別為14.46、1.47和2.11μg·h·mL-1，原藥組中的22，23-二氫麥角甾醇在血液中未被檢測到。(3)尾靜脈注射后，微乳組、脂質(zhì)體組和納米膠束組中的麥角甾醇在血漿中的消除半衰期t1/2分別為0.75、0.86和0.72h，AUC0-10分別為101.16、91.83和124.10μg·h·mL-1，22，23-二氫麥角甾醇的t1/2分別為0.85、0.85和0.75 h，AUC0-10分別為5

12、0.60、43.22和56.16μg·h·mL-1。由于甾醇原藥以微?；鞈乙盒问浇o藥，以至于原藥組的靜脈注射血藥濃度未能得到。藥動學(xué)研究結(jié)果表明，納米制劑提高了甾醇在大鼠體內(nèi)的生物利用度。
　　 6.以金針菇甾醇原藥為對照，通過不同給藥途徑分別給予小鼠三種金針菇甾醇納米制劑，同時測定麥角甾醇和22，23-二氫麥角甾醇在組織和糞便中的濃度，研究金針菇甾醇納米制劑在小鼠體內(nèi)的分布情況。(1)口服給藥1 h后，納米制劑的藥物能分布到大

13、部分組織中，主要是在血流充足的肝、脾、肺和腎等組織。由于原藥吸收緩慢，原藥組1 h在各臟器中均未檢出藥物。各組的藥物在心臟和腦組織中分布很少或沒有分布。由于藥物口服吸收的tmax在5～8 h，因此各組的藥物濃度普遍很低。在4 h時，納米膠束組和原藥組有大量的藥物隨糞便排出。(2)腹腔注射給藥1 h后，除了心臟和腦組織，納米制劑的藥物能分布到其余組織中。脂質(zhì)體組和納米膠束組的藥物在肝臟中分布最多，其次是脾、肺、腎以及胃。與前兩組相比，微乳