重組人B7-H1IgV腫瘤疫苗的發(fā)酵純化工藝研究和抑瘤活性的檢測(cè).pdf

1、目的：B7-H1是共刺激分子B7-H1家族成員，B7-H1主要通過(guò)其IgV樣區(qū)與受體PD-1結(jié)合發(fā)揮免疫抑制作用，參與腫瘤的免疫逃逸。近年來(lái)的研究表明，阻斷B7-H1，可以顯著的抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室先前構(gòu)建了重組人B7-H1IgV蛋白，檢測(cè)免疫該蛋白小鼠的抗血清活性及蛋白疫苗對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，表明重組人B7-H1IgV蛋白疫苗既可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗B7-H1抗體和腫瘤特異性的細(xì)胞免疫，又能協(xié)同其它腫瘤疫苗發(fā)揮的抗腫

2、瘤作用。為了進(jìn)一步加快該制品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，本課題擬通過(guò)全面檢定工程菌，建立穩(wěn)定的重組人B7-H1IgV工程菌菌種庫(kù)，并建立穩(wěn)定的發(fā)酵純化生產(chǎn)工藝。
　　方法：首先，通過(guò)對(duì)重組人B7-H1IgV工程菌進(jìn)行重組質(zhì)粒酶切鑒定和序列分析、IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)水平的檢測(cè)、連續(xù)傳代50代的工程菌每隔10代進(jìn)行攜帶質(zhì)粒及其表達(dá)目的蛋白穩(wěn)定性的檢測(cè)，形態(tài)學(xué)的電鏡觀察，革蘭氏染色檢定和生化反應(yīng)的檢定，建立穩(wěn)定可靠的工程菌菌庫(kù)；然后依次通過(guò)5L發(fā)酵罐連

3、續(xù)三批工程菌的發(fā)酵，裂菌，包涵體溶解，建立穩(wěn)定的發(fā)酵工藝，再通過(guò)目的蛋白的復(fù)性，兩次Ni親和層析純化，建立穩(wěn)定可靠的純化工藝；最后通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)生產(chǎn)的目的蛋白的免疫原性，抑瘤活性進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：工程菌重組質(zhì)粒的酶切和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致，目的蛋白表達(dá)量達(dá)到10％以上，工程菌連續(xù)傳50代，每隔10代的工程菌質(zhì)粒酶切結(jié)果和目的蛋白表達(dá)水平均一致，電鏡結(jié)果顯示工程菌呈明顯的大腸桿菌形態(tài)，且無(wú)其它微生物的污染，革蘭氏染色結(jié)果顯示工程菌

4、呈革蘭氏陰性，各項(xiàng)生化反應(yīng)檢定結(jié)果表明工程菌為大腸桿菌。5L發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵3批工程菌均可得到約190克濕菌，且各批菌表達(dá)目的蛋白水平均在10％以上。添加GSH/GSSG氧化還原系統(tǒng)參與蛋白復(fù)性，顯著提高了復(fù)性過(guò)程目的蛋白的可溶性，兩次Ni親和層析純化目的蛋白，純度達(dá)到95％以上。B7-H1IgV蛋白免疫小鼠，兩周內(nèi)抗B7-H1的抗血清可達(dá)到1×104以上，B7-H1IgV能夠顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，抑瘤率達(dá)到30％。
　　結(jié)論