重組南瓜胰蛋白酶抑制劑Ⅰ的表達參數(shù)優(yōu)化、純化工藝及其抑瘤活性研究.pdf

1、南瓜胰蛋白酶抑制劑I(Cucurbita maxima trypsin inhibitor I，CMTII)是一種來源于南瓜籽的經(jīng)典類絲氨酸蛋白酶抑制劑，該家族由20多種成員組成。CMTI的分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、作用機制清楚，是研究活性蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及作用機制的良好工具。但是CMTI家族各成員在分子量和結(jié)構(gòu)方面相近，目前通過分離手段從南瓜籽中大量獲得單一CMTI比較困難，從而限制了其藥用開發(fā)研究。為此，我室構(gòu)建了表達重組CMTI

2、I(rCMTII)的GSll5畢赤酵母工程菌。為了對rCMTII進行深入的研究與開發(fā)，本論文研究和優(yōu)化了rCMTI I的表達條件，研究制備了rCMTII親和純化介質(zhì)和純化工藝，并首次研究了rCMTII的抑瘤和抑制腫瘤細(xì)胞降解基質(zhì)膜的活性。研究內(nèi)容與結(jié)果主要有以下幾個方面。 1．不同發(fā)酵參數(shù)對rCMTII表達的影響研究 本研究利用含CMTII基因的GSll5畢赤酵母菌，發(fā)酵表達rCMTII。通過發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)添加鎂離子和酵

3、母氮源可以增加CMTI的表達量，分別增加了15％和21％。研究發(fā)現(xiàn)pH值的變化對發(fā)酵培養(yǎng)有明顯作用，利用緩沖液保證發(fā)酵環(huán)境適當(dāng)?shù)膒H值可以促進CMTII的表達。通過正交試驗找到了實現(xiàn)rCMTII高表達的最佳參數(shù)組合為：酵母氮源1.34％，胰蛋白胨8％，葡萄糖8％，鎂離子(10mg/L)，pH值6.0。用優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)進行發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)表達上清中的rCMTII活性是優(yōu)化前的2.8倍。使用無機鹽培養(yǎng)基發(fā)酵試驗得到的表達上清中rCMTII活性略低

4、于YPD培養(yǎng)基。 2．rCMTII親和層析介質(zhì)的制備及rCMTIl分離純化工藝的研究 采用親和分離技術(shù)對rCMTII進行了分離純化。首先用環(huán)氧氯丙烷活化黏膠纖維，并以胰蛋白酶為配基交聯(lián)于其上獲得了親和層析介質(zhì)，還考察了固定化條件以及固定酶的性質(zhì)。然后用所制備的親和層析介質(zhì)從含有表達產(chǎn)物的培養(yǎng)基上清中直接分離純化rCMTII。最后通過Sephadex G-10層析對獲得的洗脫液冷凍干燥品進行脫鹽，再用Sephadex

5、 G-25層析進一步純化，獲得了基本純化的：rCMTII。 3．rCMTII的抑瘤活性研究 研究了rCMTII的抑瘤活性，發(fā)現(xiàn)rCMTII對肺癌PG細(xì)胞和乳腺癌MDA細(xì)胞的增殖有非常明顯的抑制作用，并且這種抑制呈明顯的劑量一效應(yīng)和時間一效應(yīng)關(guān)系，在9．380x10<’-2>μmol/mL濃度對兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率可達80％以上。本結(jié)果預(yù)示著rCMTII有抗腫瘤作用。 研究結(jié)果了rCMTII的抑制腫瘤細(xì)胞體外降解

6、基質(zhì)膜作用，證明rCMTII在9.380x10<’-2>μmol/mL濃度對兩種腫瘤細(xì)胞降解ECV304基質(zhì)膜活性抑制率達到50％以上，預(yù)示著rCMTII有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。 本研究取得的主要研究成果有： (1)在單因素考察的基礎(chǔ)上，利用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了含CMTII基因的GSll5畢赤酵母工程菌發(fā)酵表達rCMTII的參數(shù)，該參數(shù)為：酵母氮源1.34％，胰蛋白胨8％，葡萄糖8％，鎂離子(10mg/L)，pH值6.0。用優(yōu)化

7、發(fā)酵參數(shù)進行發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)表達上清中的rCMTII活性是優(yōu)化前的2.8倍。 (2)研究制備了偶聯(lián)有胰蛋白酶的黏膠纖維親和層析介質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上研究建立了從工程菌發(fā)酵表達的上清液中分離純化rCMTII的工藝，該工藝適合規(guī)模化生產(chǎn)。 (3)首次研究證明rCMTII具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞降解基質(zhì)膜的活性，揭示rCMTII可能具有抗腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。 本研究對小分子活性肽的表達、分離純化具有指導(dǎo)意義，為