PRMT2基因的miRNA載體構建及其活性鑒定.pdf

1、目的：
　　構建人蛋白質精氨酸甲基轉移酶2（protein arginine methyltransferase2, PRMT2）基因的miRNA真核表達載體，利用microRNA靶向PRMT2基因，鑒定其轉染乳腺癌細胞株MCF7后的生物活性。
　　方法：
　　根據 PRMT2基因序列設計合成4對pre-miRNA片段，定向克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表達載體上，采用菌落PCR和測序分析鑒定

2、插入序列的完整性；并將重組載體轉染至MCF7細胞株中，采用Western blot方法鑒定重組載體轉染MCF7細胞后對PRMT2蛋白表達的干擾效果，以及螢火蟲熒光素酶雙報告基因系統(tǒng)檢測PRMT2及其重組體對ERα轉錄活性影響。
　　結果：
　　1．構建的重組體插入片段的堿基序列完全正確，間接免疫熒光法和western blot法檢測表明：重組體穩(wěn)定轉染MCF7細胞后可成功干擾PRMT2基因的表達。
　　2．重組體轉染組

3、 miPRMT2-1，miPRMT2-2，miPRMT2-3，miPRMT2-4四個重組體轉染組的蛋白表達水平中，miPRMT2-3重組轉染體蛋白表達減低最明顯。
　　3.與未轉染組及control-miRNA組相比,穩(wěn)定轉染miPRMT2的MCF7細胞對雌激素的敏感性明顯下降。
　　4. PRMT2及其重組體對ERE-LUC轉錄活性的抑制是雌激素依賴的。在無E2刺激的條件下，PRMT2及其重組體對ERE-LUC轉錄活性無明