FUT3靶向miRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其在胃癌基因治療中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 多年研究發(fā)現(xiàn)Lewis血型抗原表達(dá)于消化道上皮組織表面并與幽門螺桿菌(HP)引起胃癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。Lewis血型抗原中Leb可與HP的BabA特異結(jié)合，是HP粘附的主要受體之一。實(shí)驗(yàn)證明含Leb的可溶性糖蛋白或抗Leb的抗體能抑制Hp黏附于胃上皮細(xì)胞。Leb的表達(dá)受Le(FUT3)基因和Se(FUT2)基因的共同調(diào)控，兩種基因表達(dá)的變化會(huì)影響到Leb抗原的合成。 本研究將從FUT3基因入手，以較高表達(dá)Lew

2、is血型抗原的胃癌細(xì)胞系KATO-Ⅲ為研究對象，通過RNAi技術(shù)中的miRNA干涉α-1，3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(即FUT3酶，由FUT3基因編碼)的合成和表達(dá)，研究其降低胃癌細(xì)胞Leb的表達(dá)從而抑制HP對胃上皮細(xì)胞的黏附的作用，并觀察FUT3基因沉默對胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。本課題的研究將有利于探討腫瘤等重大疾病的發(fā)病機(jī)制，為腫瘤的靶向基因治療提供新的思路和手段。 目的： 本研究旨在利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建FUT3基

3、因的miRNA干擾質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miR;通過體外試驗(yàn)探討FUT3的miRNA干擾質(zhì)粒抑制胃癌細(xì)胞系KATO-Ⅲ的Lewis抗原表達(dá)及腫瘤細(xì)胞生長的作用機(jī)理，以期為胃癌治療提供新的基因治療手段，同時(shí)為獲得FUT3基因的最佳miRNA序列應(yīng)用于臨床胃癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1)選擇2個(gè)符合條件的靶向FUT3的miRNA序列，分別體外合成兩段互補(bǔ)的寡核苷酸，與線性載體pcDNATM6.

4、2-GW/EmGFP-miREXPRESSIONVECTOR連接；確定構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)染KATO-Ⅲ細(xì)胞； 2)將脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體以不同劑量及濃度配比轉(zhuǎn)染KATO-Ⅲ細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，篩選出最佳陽離子脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體配比； 3)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞48小時(shí)后，RT-PCR法檢測FUT3基因在mRNA水平的變化;應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)檢測Lewis抗原表達(dá)變化；篩選出FUT3的最佳miRNA序列。 4

5、)用篩選出的FUT3miRNA轉(zhuǎn)染KATO-Ⅲ細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV/PI雙染色法)檢測FUT3基因的表達(dá)抑制對KATO-Ⅲ細(xì)胞生長的影響及誘導(dǎo)凋亡作用。 結(jié)果： 1)基因測序結(jié)果表明插入片段的序列與合成的FUT3寡核苷酸序列完全相符，即成功構(gòu)建針對FUT3基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miR表達(dá)載體。 2)篩選出最佳的陽離子脂質(zhì)體/質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配比為8μ

6、l:2μg。 3)RT-PCR結(jié)果表明在mRNA水平上所構(gòu)建的兩個(gè)質(zhì)粒都可抑制FUT3基因的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示所構(gòu)建的質(zhì)粒均可抑制Leb抗原水平的表達(dá)。與空載體對照相比，pcDNATM6.2-FUT3-miRNA2比pcDNATM6.2-FUT3-miRNA1抑制效果更明顯。 4)MTT實(shí)驗(yàn)表明FUT3基因的表達(dá)減少能明顯抑制KATO-Ⅲ的生長；用流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV/PI雙染色法)檢測發(fā)現(xiàn)